L’obiettivo del presente protocollo è quello di fornire una guida dettagliata per eseguire esperimenti di 3D “fegato-on-a-chip” infezione con virus dell’epatite B.
Nonostante l’eccezionale infettività del virus dell’epatite B (HBV) in vivo, dove solo tre genomi virali possono comportare una cronicità di scimpanzé infettati sperimentalmente, più modelli in vitro richiedono diverse centinaia di migliaia di genomi virali per la cellula in al fine di avviare un infezione transitoria. Inoltre, 2D statici colture di epatociti umani primari (PHH) consentono solo studi di breve durata a causa della loro rapida dedifferenziazione. Qui, descriviamo culture di fegato-on-a-chip 3D di PHH, monocolture o in cocultures con altre cellule di fegato-residente parenchimale. Questi offrono un miglioramento significativo nello studio a lungo termine infezioni da HBV con risposte di host fisiologico delle cellule. Oltre a facilitare gli studi di efficacia del farmaco, analisi tossicologica e indagini sulla patogenesi, questi sistemi di cultura microfluidici consentono la valutazione delle terapie curative per l’infezione da HBV volti ad eliminare covalentemente chiuso, circolare (ccc) del DNA. Presentato il metodo descrive il set-up di monocolture PHH e PHH/Kupffer cellule co-culture, loro infezione con HBV purificato e l’analisi della risposta ospite. Questo metodo è particolarmente indicato per la valutazione degli effetti a lungo termine dell’infezione da HBV, combinazioni di trattamento e patogenesi.
Lo studio di HBV è stato complicato dalla scarsa suscettibilità dei sistemi di coltura, che richiedono diverse centinaia di migliaia di copie del genoma HBV per cella per avviare l’ infezione1. Inoltre, epatociti umani primari sono generalmente estremamente fragili e rapidamente dedifferentiate durante le colture convenzionali2. Questo è dovuto principalmente al fatto che le superfici in plastica piane e dura non imitare gli ambienti naturali extracellulari trovati all’interno del fegato e la generale mancanza di ossigenazione delle culture in assenza di circolazione di microfluidica. Culture tradizionali dell’epatocita statico sulle piastre rivestite con collagene rapidamente dedifferentiate e perdono la loro suscettibilità all’ infezione di HBV3. Qui, descriviamo il set-up e l’infezione di PHH coltivate in 3D culture di fegato-on-a-chip, che sono enormemente vantaggiose sopra le colture statiche 2D convenzionali PHH sulle piastre rivestite con collagene grazie alla loro estesa competenza funzionale e metabolica, facilitando colture a lungo termine di almeno 40 giorni4. In questo sistema, PHH sono seminati su impalcature rivestite con collagene, che sono continuamente irrorate con terreno di coltura per la fornitura di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule. Anche se sistemi di cultura alternativa per PHH basati su complessi cocultures di fibroblasti murini o sviluppo 3D in sferoidi sono stati convalidati e sono suscettibili di infezione da HBV con molteplicità di infezione di 500 equivalenti di genoma (GE) di HBV per la cellula, 3D fegato-on-a-chip culture rimangono il sistema unico modello in vitro suscettibile di 0.05 GE di HBV per cella4. Questo è inoltre sostenuto dalla necessità dell’utilizzo di alte concentrazioni di solfossido dimetilico (DMSO) e polietilenglicole (PEG) per stabilire l’infezione da HBV in queste culture, che non è indispensabile per l’infezione dei sistemi di coltura di fegato-on-a-chip 3D 4. tra i principali tratti distintivi dell’HBV infezione è la piscina di cccDNA, che agisce come il modello trascrizionale per tutti de novo–prodotto virioni5,6. Anche se cccDNA può essere rilevata in convenzionale dell’epatocita culture7,8, rimane poco chiaro se la regolazione del cccDNA ed eventuali approcci terapeutici volti a sua eliminazione sono ricapitolati parzialmente o completamente dedifferentiated epatociti. Abbiamo dimostrato che cccDNA funzionalmente è formata nelle culture di fegato-on-a-chip 3D, risponde a stimoli fisiologici e possa essere mirato interferendo con l’accessibilità del macchinario trascrizionale al genoma cccDNA4.
Risposta dell’ospite all’infezione di HBV in 3D mimica di fegato-on-a-chip quelli osservati in pazienti con infezione da HBV, che consentano l’identificazione di biomarcatori per infezione, così come successo terapeutico. Tra le caratteristiche uniche delle culture di fegato-on-a-chip è la capacità di valutare le risposte ospite a lungo termine tra PHH e altre cellule parenchimale all’interno del fegato, incluse Kupffer cellule4e cellule stellate9fegato sinusoidale cellule endoteliali10,11. Questo offre l’opportunità unica per valutare interazioni cellula/cellula in un microambiente 3D complessa.
Inoltre, il periodo di coltura estesa di questa piattaforma facilita la valutazione dei trattamenti farmacologici sequenziale e il loro impatto sulla persistenza di HBV, che non sono possibili utilizzando sistemi di coltura convenzionale dell’epatocita.
Questo protocollo descrive come 3D fegato-on-a-chip culture vengono generate, monocolture di PHH o per cocultures di PHH con cellule di Kupffer. Inoltre, descriviamo la produzione di HBV purificata per gli studi di basso-molteplicità di infezione, come pure l’analisi successiva di host e risposte virali.
Le sfide nel mantenimento di colture a lungo termine di PHH hanno guidato lo sviluppo di diversi modelli di cultura con una maggiore funzionalità e longevità, ciascuno che esibiscono differenziali vantaggi e svantaggi. Ora è ampiamente riconosciuto che culture statiche 2D di PHH sono che imita alcuni aspetti della biologia dell’epatocita per quantità molto limitata di tempo. Così, bioerodibili cocultures12,13, sferoide culture14,15, e16,di culture di fegato-on-a-chip 3D17 stanno rapidamente sostituendo questi sistemi più di base. Soprattutto quando lo studio delle malattie infettive, che hanno si con il loro ospite di utilizzare specifici microambienti, il requisito per fornire ambienti fisiologici è sostenuto dalla natura spesso impegnativa di coltura umana-Tropico malattie infettive, tra cui il virus dell’epatite C, HBV e la malaria.
La fase più critica nell’esecuzione 3D fegato-on-a-chip culture è la qualità dei tipi cellulari primarie inizialmente provenienza. Queste cellule devono essere testate per la loro capacità di aderenza e solo placcabili PHH lotti dovrebbero essere utilizzati al fine di garantire la formazione di tessuto di successo e la generazione di cultura. Anche se PHH appena isolato può essere utilizzato, loro crioconservazione è solitamente complicato e richiede speciali congelatori tasso-controllato.
In contrasto con le colture 2D statiche convenzionali, il background genetico di host è trascurabile per quanto riguarda la suscettibilità all’infezione da HBV, e tutti i donatori dell’epatocita testata-finora sono in grado di stabilire l’infezione di HBV4.
Anche se derivato paziente HBV stabilisce infezioni delle culture 3D, è imperativo utilizzare PEG-precipitata e saccarosio cuscino-purificato HBV ogni volta utilizzando viscoelastica HBV produttore cella linee per la generazione di inoculi virali. Surnatanti delle cellule direttamente applicati alle culture di fegato-on-a-chip 3D, sia attraverso la presenza di fattori inibitori o a causa di un’incompatibilità di fattori di crescita presenti con epatociti, non facilmente provocare infezione. Inoltre, quando si seleziona paziente-derivato inoculi virali, solo siero dovrebbe essere usato, poiché al plasma inevitabilmente coagula e ostruisce la circolazione di microfluidica della piattaforma cultura.
Indipendentemente dal fatto l’inoculo virale utilizzato, garantendo la vitalità cellulare e la differenziazione, nonché a garantire la rimozione completa dell’inoculo iniziale da HBV, è chiave a successo studi di infezione a lungo termine. Il modo più conveniente per fare questo è campionamento culture dopo la rimozione dell’inoculo virale, come pure la misurazione dei livelli di albumina sierica umana per tutto il periodo di cultura. Della nota, allo stesso modo per tutte le altre piattaforme descritte, l’infezione da HBV, una volta stabilito, non prontamente diffuso a cellule non infette. Il meccanismo di fondo per questo rimane evasivo, poiché l’infezione da HBV in vivo prontamente infetta la maggior parte degli epatociti all’interno del fegato.
Per quanto riguarda cocultures delle cellule PHH e Kupffer, si consiglia di eseguire prove del lotto delle cellule stellate per valutare la secrezione di IL6 e TNFα in risposta alla stimolazione dei LPS, poiché non tutti i donatori di cellule di Kupffer disponibili in commercio hanno una reattività uguale.
Cosa importante, per tutti i trattamenti farmacologici o infezione iniziale delle culture con HBV, il volume totale del pozzo (1,4 mL), anche a partire dal canale microfluidico (0,2 mL), deve tener conto per il calcolo delle concentrazioni di farmaco o dell’inoculo. Al fine di garantire un dosaggio preciso, viene eseguita una fase di lavaggio con mezzo contenente HBV o farmaci al fine di adescare il canale microfluidico.
La piattaforma utilizzata utilizza 600.000 PHH per pozzetto, che assicura gli epatociti multistrati all’interno di impalcature. Anche se il numero di cellulare può essere variato, la concentrazione di cellule selezionate garantisce risultati ottimali. Il formato di piastra detiene un totale di 12 ponteggi, che può essere aggiornata a 36 impalcature. Tuttavia, a causa dei requisiti di microfluidica, scalabilità di numeri ben più alti non è possibile fino ad oggi.
Utilizzando questi approcci, culture possono essere mantenute con prestazioni ottimali delle cellule per almeno 40 giorni, che, finora, offre opportunità senza precedenti per valutare nuovi farmaci candidati, come pure di studiare l’interazione complessa tra differenti delle cellule epatici popolazioni durante l’infezione da HBV.
The authors have nothing to disclose.
Quest’opera è stata finanziata da una sovvenzione di Starter dal Consiglio europeo della ricerca (637304), un Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z) e dalle innovazioni Bio CN.
Reagents | |||
William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X | GIBCO | 11140050 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
Trypan blue | Merck | T8154 | |
Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
G418 | SIGMA | G418-RO | |
Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
Sucrose | SIGMA | SO389 | |
Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
DAPI | SIGMA | D9564 | |
Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits/Consumables | |||
Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary cells / Cell lines | |||
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers/Probes/Standards | |||
HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
Manual torque | CN Bio innovations | ||
LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |