Målet med detta protokoll är att ge en steg för steg guide för att utföra 3-D ”lever-på-ett-chip” infektion experiment med hepatit B-virus.
Trots den enastående smitta av hepatit B virus (HBV) in vivo där endast tre virala arvsmassan kan resultera i en kronicitet av experimentellt infekterade schimpanser, kräver mest in vitro-modeller flera hundratals till tusentals virala genomer per cell i för att initiera en övergående infektion. Dessutom tillåter statisk 2D kulturer av primära humana hepatocyter (PHH) endast korttidsstudier på grund av deras snabba Dedifferentiering. Här beskriver vi 3D lever-på-ett-chip kulturer av PHH, antingen i monokulturer eller i cocultures med andra nonparenchymal levern-bosatt celler. Dessa erbjuder en betydande förbättring att studera långsiktiga HBV-infektioner med fysiologiska värden cell svaren. Förutom att underlätta drog effektstudier, toxikologisk analys och utredningar om patogenes, möjliggör dessa mikroflödessystem kultur system utvärdering av läkande terapier för HBV-infektion som syftar till att eliminera kovalent stängd, cirkulär (ccc) DNA. Presenterade metoden beskriver utformningen av PHH monokulturer och PHH/Kupffers samtidig cellkulturer, deras infektion med renat HBV och analysen av värd svar. Denna metod är särskilt lämpligt att utvärderingen av långsiktiga effekter av HBV-infektion, behandling kombinationer och patogenes.
Studien av HBV har komplicerats av dålig känslighet av kultur system, som kräver flera hundratals till tusentals HBV genomet kopior per cell att initiera infektion1. Dessutom primära humana hepatocyter generellt är exceptionellt bräcklig och dedifferentiate snabbt under konventionella kulturer2. Detta är främst på grund av att de platt och hård plast ytorna inte efterlikna naturliga extracellulära miljöer finns i levern och den allmänna avsaknaden av syresättning av kulturerna i avsaknad av mikrofabricerade cirkulation. Konventionell statisk hepatocyte kulturer på kollagen-belagda plattor snabbt dedifferentiate och förlorar sin känslighet för HBV-infektion3. Här, vi beskriver set-up och infektion i PHH odlas i 3D lever-på-ett-chip kulturer, vilket är väldigt fördelaktigt över konventionella 2D statisk PHH kulturer på kollagen-belagda plattor på grund av deras utökade metabola och funktionell kompetens, underlätta långsiktiga kulturer av minst 40 dagar4. I det här systemet är PHH seedade på kollagen-belagd ställningar, som är ständigt perfusion med odlingsmedium att leverera syre och näringsämnen till cellerna. Även om alternativa kultur system för PHH baserade på komplexa cocultures av murina fibroblaster eller 3D tillväxt i spheroids har validerats och är mottagliga för HBV-infektion med multiplicities av infektion av 500 genomet motsvarigheter (GE) av HBV per cell, 3D lever-på-ett-chip kulturer förbli den enda in vitro-modellsystem mottagliga till 0,05 GE av HBV per cell4. Detta underbyggs dessutom av nödvändigheten av att använda höga koncentrationer av dimetyl sulfoxid (DMSO) och polyetylenglykol (PEG) för att upprätta HBV-infektion i dessa kulturer, vilket är onödigt för infektion av 3D lever-på-ett-chip kultur system 4. bland de stora kännetecknen av HBV infektion är cccDNA poolen, som fungerar som transkriptionell mallen för alla de novo–producerade virioner5,6. Även om cccDNA kan upptäckas i konventionella hepatocyte kulturer7,8, det är fortfarande oklart huruvida regleringen av cccDNA och några behandlingsmetoder som syftar till dess eliminering är återgetts i delvis eller helt dedifferentiated hepatocyter. Vi har visat att cccDNA bildas funktionellt i 3D lever-på-ett-chip kulturer svarar på fysiologiska stimuli och kan riktas genom att störa tillgängligheten av transkriptionell maskiner till cccDNA genomet4.
Värd för Svaren till HBV-infektion i 3D lever-på-ett-chip härma de observerats hos HBV-infekterade patienter, möjliggör identifiering av biomarkörer för infektion, samt terapeutisk framgång. Bland de unika funktionerna i levern-på-ett-chip kulturer är förmågan att utvärdera långsiktiga värd Svaren mellan PHH och andra nonparenchymal celler i levern, inklusive Kupffers celler4, stjärnformade celler9och levern sinusformad endotelceller10,11. Detta ger en unik möjlighet att utvärdera cell/cell interaktioner i en komplex 3D mikromiljö.
Dessutom underlättar perioden utökade kultur av denna plattform utvärderingen av sekventiell läkemedelsbehandlingar och deras inverkan på HBV uthållighet, som inte är möjliga med konventionella hepatocyte kultur system.
Det här protokollet beskriver hur 3D lever-på-ett-chip kulturer genereras, antingen för monokulturer av PHH eller för cocultures av PHH med Kupffers celler. Dessutom beskriver vi produktionen av renat HBV för låg-mångfald-av-infektion studier, samt den efterföljande analysen av värd- och virala svar.
Utmaningarna att upprätthålla långsiktiga kulturer av PHH har drivit utvecklingen av flera kultur modeller med ökad funktionalitet och livslängd, varje ställer ut differential fördelar och nackdelar. Det är nu allmänt erkänt att statiska 2D kulturer av PHH imitera vissa aspekter av hepatocyte biologi för mycket begränsade mängder av tid. Således micropatterned cocultures12,13, sfäroid kulturer14,15, och 3D lever-på-ett-chip kulturer16,17 ersätter snabbt dessa mer grundläggande system. Särskilt när man studerar infektionssjukdomar, som har coevolved med sin värd att utnyttja särskilda mikromiljö, underbyggs kravet på att tillhandahålla fysiologiska miljöer av odla mänskliga-tropic ofta utmanande natur smittsamma sjukdomar, inklusive hepatit C-virus, HBV och malaria.
Det mest kritiska steget i utför 3D lever-på-ett-chip kulturer är kvaliteten på de först inköpta primära celltyper. Dessa celler ska testas för sin följsamhet kapacitet och endast plateable PHH massor bör användas för att säkerställa framgångsrika vävnad bildning och kultur generation. Även om färska isolerade PHH kan användas, deras frysförvaring är vanligtvis komplicerade och kräver särskild kurs-kontrollerade frysar.
I motsats till konventionella statiska 2D kulturer, värd genetiska bakgrunden är försumbar när det gäller känslighet för HBV-infektion, och alla-hittills testade hepatocyte givare kunna upprätta HBV infektion4.
Även om patientderiverade HBV fastställer infektioner av 3D kulturer, det är absolut nödvändigt att utnyttja PEG-fällt och sackaros kudde-renat HBV när använda inducerbara HBV producent cell linjer för generering av viral inokulat. Cell cellkulturer direkt tillämpas på 3D lever-på-ett-chip kulturer, antingen genom närvaron av hämmande faktorer eller på grund av inkompatibilitet av nuvarande tillväxtfaktorer med hepatocyter, leder inte lätt till infektion. Dessutom, när du väljer patientderiverade viral inokulat, bör endast serum användas, eftersom plasma oundvikligen koagulerar och träskor mikroflödessystem cirkulationen av kultur plattformen.
Oavsett den virala inokulum används, är cellulära livskraft och differentiering, liksom att säkerställa fullständig borttagning av den inledande HBV inokulatet, nyckeln till framgångsrik långtidsstudier av infektion. Det mest bekväma sättet att göra detta är provtagning kulturer efter avlägsnande av det virala inokulatet, samt mäta humant serumalbumin nivåer under hela kulturen. Notera, på samma sätt som alla andra beskrivna plattformar, HBV-infektion när etablerad, sprids lätt inte till oinfekterade celler. Den underliggande mekanismen för detta är fortfarande gäckande eftersom HBV-infektion i vivo smittar lätt majoriteten av hepatocyter inom levern.
När det gäller cocultures av PHH och Kupffers celler är det lämpligt att utföra mycket tester av Kupffers celler att utvärdera IL6 och TNFα sekretion i LPS stimulering eftersom inte alla kommersiellt tillgängliga Kupffers celler givare har en lika lyhördhet.
Viktigast av allt, för alla läkemedelsbehandlingar eller initial infektion av kulturer med HBV, måste den totala volymen av brunnen (1,4 mL), samt per mikroflödessystem kanalen (0,2 mL), beaktas för beräkning av drog- eller inokulum koncentrationer. För att säkerställa korrekt dosering, utförs ett tvätt steg med medium innehållande HBV eller droger för att prime mikroflödessystem kanalen.
Den plattform som används använder tredjeparts 600.000 PHH per brunn, vilket garanterar multilayered hepatocyter inom ställningar. Även om antalet cell kan varieras, garanterar valt cellkoncentrationen optimala resultat. Det platta formatet rymmer totalt 12 ställningar, som kan uppgraderas till 36 ställningar. Dock på grund av mikrofabricerade krav går skala upp till högre väl siffror inte hittills.
Med hjälp av dessa metoder, kan kulturer upprätthållas med optimal cell prestanda för minst 40 dagar, som, hittills, erbjuder oöverträffade möjligheter att utvärdera nya läkemedelskandidater, samt studera det komplexa samspelet mellan olika nedsatt cell populationer under HBV-infektion.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades genom en Starter bidrag från European Research Council (637304), en Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z), och CN Bio innovationer.
Reagents | |||
William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X | GIBCO | 11140050 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
Trypan blue | Merck | T8154 | |
Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
G418 | SIGMA | G418-RO | |
Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
Sucrose | SIGMA | SO389 | |
Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
DAPI | SIGMA | D9564 | |
Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits/Consumables | |||
Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary cells / Cell lines | |||
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers/Probes/Standards | |||
HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
Manual torque | CN Bio innovations | ||
LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |