Cellecyklus analyse i C. elegans kønscelleoverførsel med Thymidine Analog EdU
Summary
En billeddannelse-baseret metode er beskrevet som kan bruges til at identificere S-fase og analysere cellecyklus dynamics i C. elegans hermafrodit kønscelleoverførsel ved hjælp af thymidine analog EdU. Denne metode kræver ingen transgener og er kompatibel med immunfluorescent farvning.
Abstract
Cellecyklus analyse i eukaryoter udnytter ofte kromosom morfologi, udtryk og/eller lokalisering af genprodukter, der kræves til forskellige faser i cellecyklus eller indarbejdelse af nucleoside analoger. Under S-fase, DNA polymeraser indarbejde thymidine analoger såsom EdU eller BrdU kromosomale DNA, markere cellerne for analyse. For C. elegans, nucleoside analog EdU er fodret til orme under regelmæssig kultur og er kompatibel med immunfluorescent teknikker. Kønscelleoverførsel af C. elegans er en kraftfuld modelsystem for undersøgelserne af signalering stier, stamceller, meiose og cellecyklus, fordi det er gennemsigtigt, genetisk letkøbt, og meiotiske prophase og cellulære differentiering/gametogenesis sker i en lineær forsamling-lignende måde. Disse funktioner gør EdU et fantastisk værktøj til at undersøge dynamiske aspekter af mitotically cykling celler og kønscelleoverførsel udvikling. Denne protokol beskriver hvordan man med held forberede EdU bakterier, fodre dem til vilde-type C. elegans hermafroditter, dissekere den hermafrodit gonade, pletten til EdU indbygning i DNA, pletten med antistoffer til at opdage forskellige cellecyklus og udviklingsmæssige markører, billede af gonade og analysere resultaterne. Protokollen beskriver variationer i metode og analyse til måling af S-fase indeks, M-fase indeks, G2 varighed, celle cyklus varighed, rente af meiotiske post og sats af meiotiske prophase progression. Denne metode kan tilpasses for at studere cellecyklus eller celle historie i andre væv, stadier, genetiske baggrunde og fysiologiske tilstande.
Introduction
I dyrenes udvikling skal hundreder, tusinder, millioner, milliarder, eller endog trillioner af celledelinger danne den voksne organisme. Cellecyklus, cellulære begivenheder sæt sammensat af G1 (gap), S (syntese), G2 (gap), og M (mitose) definerer serien af begivenheder, der er udført hver celledeling. Cellecyklus er dynamisk og bedst værdsat i realtid, som kan være teknisk vanskeligt. De teknikker præsenteret i denne protokol tillader en at foretage målinger af faserne og timing af cellecyklus fra stillbilleder.
Mærkning med nucleoside analoger som 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) eller 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) er guldstandarden til at identificere S-fase i undersøgelserne af cellecyklus dynamics i Caenorhabditis elegans (C. elegans) voksen hermafrodit kønscelleoverførsel1,2,3,4,5. Både EdU og BrdU kan bruges i næsten alle genetiske baggrund, som de ikke stole på nogen genkonstruktion. Visualisere BrdU kræver skrappe kemiske behandling at afsløre antigener for anti-BrdU antistof farvning, der er ofte uforenelige med vurderingen af andre cellulære markører visualiseres ved farvning Co med ekstra antistoffer. Derimod visualisere EdU opstår ved klik kemi under milde forhold og er således kompatibel med antistof Co farvning6,7.
Specificiteten af etiketten er klar, da kerner kun optage thymidine (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) analoger i DNA S-fasen. Visualisering foregår i faste væv. EdU etiketten er usynlig selv indtil en indeholder-holdige farvestof eller fluorophore reagerer kovalent med alkyn i EdU af kobber-katalyseret Klik kemi8. EdU mærkning kan give øjeblikkelig information hvorpå kerner er i S-fase, med en kort puls af mærkning. EdU kan også give dynamiske oplysninger, ved hjælp af puls-chase eller kontinuerlig mærkning; for eksempel, i en pulse-chase eksperiment, etiketten er fortyndet på hver celledeling eller opformeret som nondividing celler fremskridt gennem udvikling.
C. elegans hermafrodit kønscelleoverførsel er en kraftfuld modelsystem for undersøgelserne af signalering veje, stamceller, meiose og celle cyklus. Den voksne kønscelleoverførsel er en polariseret samlebånd med stamceller fundet i den distale ende efterfulgt af post og progression gennem meiotiske prophase, koordineret med faser af gametogenesis mere proksimalt (figur 1). På den proksimale ende, oocyter modne, er ægløsning og befrugtet og begynde embryogenese i livmoderen9,10,11. ~ 20 celle-diameter lang regionen nær den distale tip celle, som indeholder mitotically cykling kønscelleoverførsel stilken, stamceller og meiotiske S-fase celler men ikke cellerne i meiotiske prophase, kaldes stamfader zone2,4 , 9 , 12. cellemembraner giver ufuldstændig adskillelse mellem kerner i den distale kønscelleoverførsel, men zone stamceller gennemgå mitotiske celle cykling stort set uafhængigt af hinanden. Median mitotiske cellecyklus varigheden af kønscelleoverførsel stamceller zone i unge voksne hermafroditter er ~6.5 h; G1 fase er kort eller fraværende, og ubevægelighed er ikke observeret1,2,13. Kønscelleoverførsel stamcelle differentiering sker gennem hovedsagelig direkte differentiering og dermed mangler uddybning af transit divisioner4. Under differentiering i pachytene fase, omkring 4 ud af 5 kerner vil ikke danne oocytter, men i stedet gennemgå apoptose, handler som sygeplejerske celler ved at donere deres cytoplasmatisk indholdet at udvikle oocyt12,14 , 15.
Ud over mærkning celler i S-fase med nucleoside analoger, kan man identificere cellerne i mitosen og meiose bruger antistoffarvning. Kerner i mitosen er immunoreaktive til anti-phospho-Histon H3 (Ser10) antistof (kaldet pH3)7,16. Kerner i meiose er immunoreaktive til anti-ham-3 antistof (en meiotiske kromosom akse protein)17. Kerner i zonen Stamform kan identificeres ved fravær af HIM-3, tilstedeværelsen af nucleoplasmic REC-818eller tilstedeværelsen af WAPL-119. WAPL-1 intensitet er højest i den somatiske gonade, høj i zonen Stamform og lav under tidlige meiotiske prophases19. Flere cellecyklus målinger er muligt med et par variationer i protokollen: Jeg) identificere kerner i S-fase og måle S-fase indeks; II) identificere kerner i M-fase og måle M-fase indeks; III) afgøre, om kerner var i mitotiske eller meiotiske S-fase; IV) måle varigheden af G2; V) måle duartion af G2 + M + G1 faser; VI) foranstaltning sats af meiotiske post; VII) skøn sats af meiotiske progression.
Man kan lave flere cellecyklus målinger fra kun et par typer af våd-lab eksperimenter. Protokollen nedenfor beskriver en 30 min puls mærkning af fodring C. elegans voksen hermafroditter med EdU mærket bakterier og co mærkning M-fase celler ved farvning med anti-pH3 antistof og stamfader zone celler ved farvning med anti-WAPL-1 antistof. Kun ændringer i varigheden af EdU feed (trin 2,5), type af antistoffer ansat (trin 5), og analyser (trin 8.3) er påkrævet for de yderligere målinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forberedelse af EdU-mærket bakterier (trin 1) er afgørende for denne protokol, og det første punkt i forbindelse med fejlfinding. Wild-type unge voksne hermafroditter etiket meget pålideligt i en 4 h EdU-puls, hvilket gør dette en nyttig kontrol for hver ny batch af EdU-mærket bakterier. Derudover vil intakt EdU-mærket bakterier, som angiver tarmen (i ældre dyr eller visse svælget/kværn defekte mutanter) etiket med klik kemi og fremstår som lyse aflange puncta i tarmen. En alternativ teknik for mærkning herma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for E. coli stock center MG1693; Wormbase; Byens Caenorhabditis genetik, som er finansieret af de nationale institutter for sundhed Office af forskning infrastruktur programmer (P40OD010440) til stammer; Zach Pincus for statistisk råd; Aiping Feng for reagenser; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar og John Brenner til uddannelse, rådgivning, støtte og nyttig diskussion; og Kornfeld og Schedl labs for feedback på dette håndskrift. Dette arbejde blev støttet i en del af National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 til KK, R01 GM100756 til TS] og en National Science Foundation predoctoral fellowship [DGE-1143954 og DGE-1745038 til ZK]. Hverken National Institutes of Health eller National Science Foundation havde nogen rolle i udformningen af undersøgelsen, indsamling, analyse og fortolkning af data, og heller ikke i at skrive manuskriptet.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
Riferimenti
- Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).
- Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
- Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetica. 201 (9), 167-184 (2015).
- Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
- ThermoFisher. . Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).
- Pazdernik, N., Schedl, T. . Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).
- Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Biologia dello sviluppo. 49 (1), 200-219 (1976).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
- Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Biologia dello sviluppo. 308 (1), 206-221 (2007).
- Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetica. 208 (2), 745-762 (2018).
- Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).
- Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
- Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
- Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Biologia dello sviluppo. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
- Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
- Vos, K. . De Cell Counter Plugin. , (2015).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rasband, W. . ImageJ. , (2016).
- Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), 671-680 (2010).
- Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
- Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
- Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
- . . Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).
- Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).
