Thymidine अनुरूप EdU के साथ C. एलिगेंस Germline में कक्ष चक्र विश्लेषण
Summary
एक इमेजिंग-आधारित पद्धति वर्णित है कि S-चरण पहचानने और thymidine अनुरूप EdU का उपयोग कर C. एलिगेंस द्विलिंग germline में कक्ष चक्र गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । इस विधि कोई transgenes की आवश्यकता है और immunofluorescent धुंधला के साथ संगत है ।
Abstract
सेल साइकिल विश्लेषण eukaryotes में अक्सर गुणसूत्र आकृति विज्ञान, अभिव्यक्ति और/या जीन उत्पादों के स्थानीयकरण सेल चक्र के विभिंन चरणों के लिए आवश्यक का उपयोग करता है, या nucleoside अनुरूप के शामिल । एस-चरण के दौरान, डीएनए polymerases गुणसूत्र डीएनए में ऐसे EdU या BrdU के रूप में thymidine अनुरूप शामिल, विश्लेषण के लिए कोशिकाओं अंकन । C. एलिगेंसके लिए, nucleoside एनालॉग EdU नियमित रूप से संस्कृति के दौरान कीड़े को खिलाया जाता है और immunofluorescent तकनीकों के साथ संगत है । C. एलिगेंस के germline संकेत रास्ते के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है, स्टेम सेल, अर्धसूत्रीविभाजन, और कोशिका चक्र क्योंकि यह पारदर्शी है, आनुवंशिक रूप से सतही, और meiotic दौर और सेलुलर भेदभाव/gametogenesis में होते हैं रैखिक विधानसभा-फैशन की तरह । ये सुविधाएं mitotically सायक्लिंग कोशिकाओं और germline विकास के गतिशील पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक महान उपकरण बनाने के लिए । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे सफलतापूर्वक EdU जीवाणुओं को तैयार करने के लिए, उंहें जंगली-प्रकार सी एलिगेंस hermaphrodites, काटना द्विलिंग gonad, डीएनए में EdU के लिए दाग, एंटीबॉडी के साथ दाग के लिए विभिंन सेल चक्र का पता लगाने के लिए फ़ीड और विकास मार्करों, छवि gonad और परिणामों का विश्लेषण । प्रोटोकॉल पद्धति और एस के माप के लिए विश्लेषण में बदलाव का वर्णन चरण सूचकांक, एम चरण सूचकांक, G2 अवधि, सेल चक्र अवधि, meiotic प्रवेश की दर, और meiotic दौर प्रगति की दर । इस विधि के लिए सेल चक्र या अंय ऊतकों, चरणों, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, और शारीरिक स्थितियों में सेल के इतिहास का अध्ययन अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
पशु विकास में, सैकड़ों, हजारों, लाखों, अरबों, या सेल डिवीजनों के भी खरब वयस्क जीव बनाने के लिए आवश्यक हैं । सेल साइकिल, G1 (गैप), एस (संश्लेषण), G2 (गैप), और एम (बँटवारा) से बना सेलुलर घटनाओं के सेट की घटनाओं है कि प्रत्येक कोशिका विभाजन निष्पादित कर रहे हैं की श्रृंखला को परिभाषित । सेल चक्र गतिशील और सबसे अच्छा वास्तविक समय में सराहना की है, जो तकनीकी रूप से मुश्किल हो सकता है । तकनीक इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत एक के चरणों और अभी भी छवियों से सेल चक्र के समय की माप बनाने के लिए अनुमति देते हैं ।
nucleoside एनालॉग के साथ लेबलिंग जैसे 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) या 5-ब्रोमो-2′-deoxyuridine (BrdU) में सेल चक्र गतिशीलता के अध्ययनों में एस चरण की पहचान करने के लिए स्वर्ण मानक है Caenorhabditis एलिगेंस (C. एलिगेंस) वयस्क द्विलिंग germline1,2,3,4,5. दोनों EdU और BrdU लगभग किसी भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि में इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में वे किसी भी आनुवंशिक निर्माण पर भरोसा नहीं है । visualizing BrdU कठोर रासायनिक उपचार की आवश्यकता है विरोधी के लिए प्रतिजन-BrdU एंटीबॉडी धुंधला है, जो अक्सर अंय सेलुलर अतिरिक्त एंटीबॉडी के साथ-दाग के द्वारा visualized मार्करों के आकलन के साथ असंगत है बेनकाब । इसके विपरीत, visualizing EdU हल्के शर्तों के तहत क्लिक रसायन विज्ञान द्वारा होता है और इस प्रकार एंटीबॉडी सह के साथ संगत है6,7धुंधला ।
लेबल की विशिष्टता स्पष्ट है, क्योंकि नाभिक केवल thymidine (5-ethynyl-2 ‘-deoxyuridine) के अनुरूप डीएनए में एस चरण के दौरान शामिल है । विज़ुअलाइज़ेशन निश्चित ऊतक में जगह लेता है । edu लेबल एक azide युक्त डाई या fluorophore द्वारा edu में alkyne के साथ covalently प्रतिक्रिया करता है जब तक स्वयं द्वारा अदृश्य है-catalyzed रसायन विज्ञान8क्लिक करें । EdU लेबलिंग तत्काल जानकारी प्रदान कर सकते हैं, जिस पर नाभिक S-phase, लेबलिंग की एक छोटी नाड़ी का उपयोग कर रहे हैं । EdU भी गतिशील जानकारी प्रदान कर सकते हैं, पल्स चेस या सतत लेबल का उपयोग; उदाहरण के लिए, किसी पल्स-चेस प्रयोग में, लेबल प्रत्येक कोशिका प्रभाग में पतला होता है या विकास के माध्यम से विभाजित कोशिकाओं की प्रगति के रूप में प्रचारित किया जाता है.
सी एलिगेंस द्विलिंग germline संकेत मार्ग, स्टेम सेल, अर्धसूत्रीविभाजन, और कोशिका चक्र के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है । वयस्क germline स्टेम कोशिकाओं के साथ एक ध्रुवीय विधानसभा लाइन है meiotic चरण के माध्यम से प्रवेश और प्रगति के बाद बाहर के अंत में पाया, अधिक समीपस्थ gametogenesis के चरणों के साथ समंवित (चित्रा 1) । समीपस्थ अंत में, अंडाणुओं परिपक्व, ovulation और निषेचित कर रहे हैं और गर्भाशय9,10,11में embryogenesis शुरू करते हैं । ~ 20 सेल व्यास बाहर की नोक सेल है, जो mitotically सायक्लिंग germline स्टेम, जनक कोशिकाओं और meiotic एस चरण कोशिकाओं को शामिल नहीं है, लेकिन meiotic दौर में कोशिकाओं के पास लंबे क्षेत्र, जनक जोन2,4 कहा जाता है , 9 , 12. कोशिका झिल्ली बाहर germline में नाभिक के बीच अधूरा जुदाई प्रदान करते हैं, लेकिन जनक क्षेत्र कोशिकाओं mitotic सेल सायक्लिंग मोटे तौर पर स्वतंत्र रूप से गुजरना । युवा वयस्क hermaphrodites में germline जनक क्षेत्र कोशिकाओं के माध्य mitotic सेल चक्र अवधि ~ ६.५ ज है; G1 चरण संक्षिप्त या अनुपस्थित है, और quiescence1,2,13नहीं मनाया जाता है । Germline स्टेम सेल विभेद अनिवार्य रूप से प्रत्यक्ष भेदभाव के माध्यम से होता है और इस प्रकार पारगमन बढ़ाना विभाजन4का अभाव है । pachytene चरण में भेदभाव के दौरान, लगभग 5 नाभिक से बाहर 4 अंडाणुओं फार्म नहीं होगा, लेकिन इसके बजाय apoptosis से गुजरना, विकासशील cytoplasmic12,14 को उनके oocyte सामग्री दान द्वारा नर्स कोशिकाओं के रूप में अभिनय , 15.
nucleoside अनुरूप के साथ एस चरण में कोशिकाओं लेबलिंग के अलावा, एक बँटवारा और अर्धसूत्रीविभाजन में एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग कर कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं. बँटवारा में नाभिक विरोधी को immunoreactive हैं-phospho-हिस्टोन H3 (Ser10) एंटीबॉडी (आरक्षी pH3)७,१६. अर्धसूत्रीविभाजन में नाभिक विरोधी उसे immunoreactive हैं-3 एंटीबॉडी (एक meiotic गुणसूत्र अक्ष प्रोटीन)17. जनक जोन में नाभिक की अनुपस्थिति से उसकी पहचान की जा सकती है-3, nucleoplasmic आरईसी की उपस्थिति-818, या WAPL की उपस्थिति-119। WAPL-1 तीव्रता दैहिक gonad में सबसे अधिक है, जनक क्षेत्र में उच्च, और जल्दी meiotic19के दौर के दौरान कम । कई कोशिका चक्र माप प्रोटोकॉल में कुछ बदलाव के साथ संभव है: I) एस चरण और माप एस चरण सूचकांक में नाभिक की पहचान; II) एम-फेज में नाभिक की पहचान करना और एम-फेज इंडेक्स को मापने; III) निर्धारित करें कि क्या नाभिक mitotic या meiotic S-चरण में थे; IV) G2 की अवधि को मापने; V) G2 + M + G1 चरणों के duartion को मापने; VI) meiotic प्रवेश की दर को मापने; VII) meiotic प्रगति की दर का अनुमान ।
एक गीला प्रयोगशाला प्रयोगों के केवल कुछ ही प्रकार से कई सेल चक्र माप कर सकते हैं । नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है एक 30 मिनट के साथ एलिगेंस वयस्क hermaphrodites के साथ खिला सी. एम. के. -विरोधी जनक-1 WAPL के साथ दाग से एंटी-pH3 एंटीबॉडी और एंटीबॉडी क्षेत्र कोशिकाओं के साथ दाग द्वारा बैक्टीरिया और सह लेबल M-चरण कोशिकाओं लेबल । केवल EdU फ़ीड की अवधि में परिवर्तन (चरण २.५), कार्यरत एंटीबॉडी के प्रकार (चरण 5), और विश्लेषण (चरण ८.३) अतिरिक्त माप के लिए आवश्यक हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU-लेबल बैक्टीरिया (चरण 1) की तैयारी इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है, और समस्या निवारण के लिए पहला बिंदु । वाइल्ड-टाइप यंग एडल्ट hermaphrodites लेबल 4 एच EdU-पल्स में बहुत मज़बूती से, यह edu-लेबल वाले बैक्टीरिया के हर न?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम MG1693 के लिए ई. कोलाई शेयर केंद्र के लिए आभारी हैं; Wormbase; Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र जो अनुसंधान के स्वास्थ्य कार्यालय के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित है अवसंरचना कार्यक्रम (P40OD010440) उपभेदों के लिए; सांख्यिकीय सलाह के लिए Zach Pincus; रिएजेंट के लिए Aiping फेंग; ल्यूक Schneider, Andrea Scharf, संदीप कुमार, और जॉन ब्रेनर प्रशिक्षण, सलाह, समर्थन, और उपयोगी चर्चा के लिए; और इस पांडुलिपि पर प्रतिक्रिया के लिए Kornfeld और Schedl लैब्स । इस काम के भाग में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था [R01 AG02656106A1 to केके, R01 GM100756 टू टीएस] और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन डॉक्टरेट फैलोशिप [डीजीई-११४३९५४ और डीजीई-१७४५०३८ करने के लिए ZK]. न तो स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों और न ही राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के अध्ययन, संग्रह, विश्लेषण, और आंकड़ों की व्याख्या के डिजाइन में कोई भूमिका थी, और न ही पांडुलिपि लिखने में ।
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
Riferimenti
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