Análisis de ciclo celular en la línea germinal de C. elegans con la EdU de análogo de la timidina
Summary
Se describe un método basado en la proyección de imagen que puede utilizarse para identificar la fase S y analizar la dinámica del ciclo celular en el germline hermafrodita C. elegans mediante la timidina EdU analógico. Este método no requiere transgenes y es compatible con la tinción inmunofluorescente.
Abstract
Análisis de ciclo celular en eucariotas con frecuencia utiliza la morfología del cromosoma, expresión y localización de productos génicos necesarios para diferentes fases del ciclo celular, o la incorporación de análogos de nucleósidos. Durante fase de S, polimerasas de la DNA incorporan a análogos de timidina como EdU o BrdU DNA cromosómica, las células para el análisis de la marca. Para C. elegans, el nucleósido análogo EdU se alimenta a los gusanos durante cultura regular y es compatible con técnicas de inmunofluorescencia. Germinales de C. elegans es un sistema potente para los estudios de señalización de vías, las células madre, meiosis y ciclo celular porque es transparente, genéticamente facile y profase meiótica y la diferenciación celular/gametogénesis ocurre en un forma de montaje-como lineal. Estas características hacen de EdU una gran herramienta para el estudio de aspectos dinámicos de células mitotically ciclismo y desarrollo de la línea germinal. Este protocolo describe cómo preparar EdU bacterias con éxito, darles de comer a tipo salvaje hermafroditas de C. elegans , diseccionar la gónada hermafrodita, de la mancha para la incorporación de EdU en el ADN, tinción con los anticuerpos al detectar varios ciclo celular y marcadores del desarrollo, la gónada de la imagen y analizar los resultados. El protocolo describe las variaciones en el método y el análisis para la medición de fase S índice, fase M índice, G2 duración, duración del ciclo celular, tasa de entrada meiótica y tasa de progresión de la profase meiótica. Este método se puede adaptar para estudiar el ciclo celular o la historia de células en otros tejidos, etapas, fondos genéticos y condiciones fisiológicas.
Introduction
En el desarrollo animal, cientos, miles, millones, miles de millones o incluso billones de divisiones celulares se requieren para formar el organismo adulto. El ciclo celular, el conjunto de eventos celulares por G1 (gap), S (síntesis), G2 (gap), y M (mitosis) definir la serie de eventos que son ejecutaron cada división celular. El ciclo celular es dinámica y mejor apreciado en tiempo real, que puede ser técnicamente difícil. Las técnicas presentadas en este protocolo permiten hacer las mediciones de las fases y tiempos del ciclo celular de imágenes fijas.
Etiquetado con análogos de nucleósidos como 5-ethynyl-2′-desoxiuridina (EdU) o 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) es el estándar de oro para identificar la fase S en los estudios de la dinámica del ciclo celular en el adulto de Caenorhabditis elegans (C. elegans) hermafroditas del germline1,2,3,4,5. EdU y BrdU pueden utilizarse en casi cualquier fondo genético, como no dependen de ningún concepto genética. Visualización de BrdU requiere tratamiento químico áspero para exponer el antígeno para el anticuerpo anti-BrdU de tinción, que a menudo es incompatible con la evaluación de otros marcadores celulares visualizadas mediante tinción con anticuerpos adicionales conjuntamente. Por el contrario, visualizar EdU se produce por la química del tecleo condiciones suaves y por lo tanto es compatible con el anticuerpo Co manchas6,7.
La especificidad de la etiqueta es clara, puesto que los núcleos sólo incorporan los análogos de timidina (5-ethynyl-2′-desoxiuridina) ADN durante la fase S. Visualización lleva a cabo en tejido fijo. La etiqueta de EdU es invisible por sí mismo hasta un colorante que contiene azida o fluoróforo covalente reacciona con el alquino en EdU de química cobre-catalizada del tecleo8. Etiquetado EdU puede proporcionar información inmediata en la que los núcleos son en fase S, mediante un breve impulso de etiquetado. EdU también puede proporcionar información dinámica, mediante pulso-persiga o etiquetas de continuo; por ejemplo, en un experimento de Pulso-persiga, la etiqueta se diluye en cada división celular o reproducidos como nondividing progreso de células a través del desarrollo.
El germline hermafrodita C. elegans es un sistema potente para los estudios de señalización de vías, las células madre, meiosis y ciclo celular. El germline adulto es una línea de ensamblaje polarizada con células madre en el extremo distal, seguido por la entrada y la progresión a través de la profase meiótica, coordinado con las etapas de la gametogénesis más proximal (figura 1). En el extremo proximal, ovocitos maduran, son ovularon y fertilizan y comienzan la embriogénesis en el útero9,10,11. La región larga de ~ 20 células de diámetro cerca de la célula de la punta distal, que incluye el vástago del germline mitotically ciclismo, células progenitoras y células en fase S meióticas pero no las células en profase meiótica, se llama el progenitor zona2,4 , 9 , 12. las membranas celulares proporcionan separación incompleta entre los núcleos en el germline distal, pero las células de la zona de progenitoras se someten a ciclismo en gran parte independientemente de la célula mitótica. La duración mediana ciclo celular mitótico de las células de zona de progenitor del germline en jóvenes adultos hermafroditas es ~6.5 h; Fase G1 es breve o ausente, y quietud no se observa1,2,13. Diferenciación de la célula de vástago del germline se produce a través de la diferenciación esencialmente directa y carece así de tránsito amplificando las divisiones4. Durante la diferenciación en la fase de paquiteno, aproximadamente 4 de cada 5 núcleos no forma ovocitos pero en cambio sufren apoptosis, actuando como enfermera células donando su contenido citoplasmático al ovocito en desarrollo12,14 , 15.
Además de etiquetado células en fase S con análogos de nucleósidos, uno puede identificar las células en mitosis y meiosis utilizando anticuerpos. Núcleo en la mitosis es inmunorreactivas para anti-phospho-histona H3 (Ser10) anticuerpo (llamado pH3)7,16. Los núcleos en la meiosis son immunoreactive a los anticuerpos anti-lo-3 (una proteína del eje del cromosoma meiótico)17. Núcleos en la zona del progenitor pueden identificarse por la ausencia de él-3, la presencia de nucleoplasmática REC-818o la presencia de WAPL-119. WAPL-1 intensidad es más alta en la gónada somática, alta en la zona de la progenitora y baja durante temprano meiótica prophases19. Varias mediciones de ciclo celular son posibles con algunas variaciones en el protocolo: I) identificar los núcleos en fase S y medir el índice de la fase S; II) identificar los núcleos en fase M y medir el índice de fase M; III) determinar si los núcleos estaban en S-fase mitótica o meiótica; IV) medir la duración de G2; V) medir la duración de las fases G2 + M + G1; VI) medir la velocidad de entrada meiótica; VII) estiman la tasa de progresión meiótica.
Uno puede hacer múltiples mediciones de ciclo celular de sólo algunos tipos de experimentos de laboratorio húmedo. El protocolo a continuación describe un etiquetado de pulso de 30 min por la alimentación de C. elegans adultos hermafroditas con EdU etiquetado como bacterias y células en fase M Co etiquetadas mediante tinción con el progenitor y el anticuerpo anti-pH3 las células de la zona mediante tinción con anticuerpos anti-WAPL-1. Sólo cambios en la duración de EdU de la alimentación (paso 2.5), tipo de anticuerpos emplean (paso 5), y análisis (8,3 de paso) son necesarios para las mediciones adicionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparación de bacterias etiquetadas de EdU (paso 1) es fundamental para este protocolo y el primer punto para solucionar problemas. Etiqueta tipo salvaje jóvenes adultos hermafroditas muy confiablemente en un 4 h EdU-pulso, haciendo de este un control útil para cada lote nuevo de bacterias EdU-labeled. Además, bacterias EdU-con la etiqueta intactas que entran en el intestino (en animales más viejos o ciertos mutantes defectuosos de faringe grinder) etiqueta con química del tecleo y aparecen como brillante orificio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al centro común de e. coli MG1693; Wormbase; el centro de genética de Caenorhabditis financiado por los institutos de salud oficina de investigación infraestructura programas nacionales (P40OD010440) para las cepas; Zach Pincus Consejo estadístico; Aiping Feng de reactivos; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar y John Brenner para capacitación, asesoramiento, apoyo y discusión útil; y los laboratorios Kornfeld y Schedl por comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue financiado en parte por los institutos nacionales de salud [AG02656106A1 R01 a KK, GM100756 R01 a TS] y una beca predoctoral de la Fundación Nacional de Ciencias [DGE-1143954 y DGE-1745038 a ZK]. Los institutos nacionales de salud ni la National Science Foundation tenía cualquier papel en el diseño del estudio, colección, análisis e interpretación de datos, ni por escrito el manuscrito.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
Riferimenti
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