En imaging-baserade metoden beskrivs som kan användas för att identifiera S-fas och analysera cellcykeln dynamik i den C. elegans hermafrodit könsceller med hjälp av tymidin analoga EdU. Denna metod kräver ingen transgener och är kompatibel med Immunofluorescerande färgning.
Cellcykeln analys i eukaryota organismer använder ofta tredjeparts kromosom morfologi, uttryck och/eller lokalisering av genprodukter som krävs för olika faser av cellcykeln eller införlivandet av nukleosid analoger. Under S-fasen, DNA-polymerases införliva tymidin analoger såsom EdU eller BrdU kromosomala DNA, märkning cellerna för analys. För C. elegans, nucleoside analog EdU matas till maskar under regelbunden kultur och är kompatibel med Immunofluorescerande tekniker. Könsceller av C. elegans är en kraftfull modellsystem för studier av signalering vägar, stamceller, meios och cellen cyklar eftersom det är transparent, genetiskt lättköpt och meiotiska profas och cellulär differentiering/könscellsbildning förekommer i en montering-liknande linjärt. Dessa funktioner gör EdU ett bra verktyg att studera dynamiska aspekter av mitotiskt cykling celler och könsceller utveckling. Det här protokollet beskriver hur man framgångsrikt förbereda EdU bakterier, mata dem till vildtyp C. elegans hermafroditer, dissekera den hermafrodit gonad, fläckar för EdU iblandning i DNA, fläcken med antikroppar att upptäcka olika cellcykeln och utvecklingsmässiga markörer, bild gonad och analysera resultaten. Protokollet beskrivs variationerna i metod och analys för mätning av S-fas index, M-fas index, G2 varaktighet, cellcykelns längd, andelen meiotiska inträde och meiotiska profas progressionshastigheten. Denna metod kan anpassas för att studera cellcykeln eller cell historia i andra vävnader, stadier, genetiska bakgrunder och fysiologiska förhållanden.
I djurens utveckling måste hundratals, tusentals, miljoner, miljarder, eller ens biljontals celldelningar bilda den vuxna organismen. Cellcykeln, uppsättningen cellulära händelser sammansatt av G1 (gap), S (syntes), G2 (gap), och M (Mitos) definiera serien av händelser som avrättas varje celldelning. Cellcykeln är dynamisk och bäst uppskattat i realtid, vilket kan vara tekniskt svårt. De tekniker som presenteras i detta protokoll tillåter en att göra mätningar av faser och timing av cellcykeln från stillbilder.
Märkning med nukleosid analoger såsom 5-ethynyl-2′-deoxiuridin (EdU) eller 5-brom-2′-deoxiuridin (BrdU) är den gyllene standarden att identifiera S-fas i studierna av cellcykeln dynamik i den Caenorhabditis elegans (C. elegans) vuxen hermafrodit könsceller1,2,3,4,5. Både EdU och BrdU kan användas i nästan alla genetiska bakgrund, som de inte lita på någon genetisk konstruktion. Visualisera BrdU kräver hård kemisk behandling att exponera antigenet för anti-BrdU-antikropp som färgning, och som ofta är oförenligt med bedömningen av andra cellulära markörer visualiseras genom samtidig färgning med ytterligare antikroppar. Däremot visualisera EdU sker genom att klicka på kemi under milda förhållanden och således är kompatibel med antikropp Co färgning6,7.
Noggrannheten av etiketten är tydlig, eftersom atomkärnor endast införliva de tymidin (5-ethynyl-2′-deoxiuridin) analoger DNA under S-fasen. Visualisering sker i fasta vävnad. EdU etiketten är osynliga i sig fram till en som innehåller natriumazid färgämne eller fluorophore reagerar kovalent med alkynen i EdU av koppar-katalyseras Klicka kemi8. EdU märkning kan ge omedelbar information som kärnorna är i S-fas, med en kort puls av märkning. EdU kan också ge dynamisk information, med puls-chase eller kontinuerlig märkning; till exempel i en puls-chase experiment, etiketten späds vid varje celldelning eller sprids som nondividing celler framsteg genom utveckling.
I C. elegans hermafrodit könsceller är en kraftfull modellsystem för studier av signalering vägar, stamceller, meios och cellcykeln. Den vuxna könsceller är en polariserad montering-line med stamceller som finns på den distala änden följt av intrade och progression genom meiotisk profas, samordnas med stadier av könscellsbildning mer proximalt (figur 1). På den proximala änden, oocyter mogen, är ägglossning och befruktas och påbörja embryogenes i livmodern9,10,11. ~ 20 cell-diameter lång regionen nära cellen distala spets, som omfattar mitotiskt cykling könsceller stammen, stamceller och meiotiska S-fas celler men inte cellerna i meiotiska profas, kallas stamceller zon2,4 , 9 , 12. cellmembranen ge ofullständig separation mellan atomkärnor i den distala könsceller, men de zon stamceller genomgå mitotiska cell cykling till stor del självständigt. Könsceller stamceller zon i unga vuxna hermafroditer varar median mitotiska cellcykelns ~6.5 h; G1-fasen är kort eller frånvarande, och rofylld inte iakttas1,2,13. Könsceller stamcellers differentiering sker genom i huvudsak direkt differentiering och därmed saknar transit-förstärkande divisioner4. Under differentiering i pachytene scenen, cirka 4 av 5 kärnor bildar inte oocyter men istället genomgå apoptos, agerar som sjuksköterska celler genom att donera sina cytoplasmiska innehållet till utveckla äggcellen12,14 , 15.
Förutom märkning celler i S-fas med nukleosid analoger, kan man identifiera cellerna i Mitos och meios använder antikropp färgning. Kärnorna i Mitos är immunreaktiva till anti-phospho-Histon H3 (Ser10) antikropp (kallas pH3)7,16. Kärnorna i meios är immunreaktiva till anti-honom-3 antikropp (meiotisk kromosomanalys axis protein)17. Kärnor i zonen stamceller kan identifieras genom avsaknad av HIM-3, förekomsten av nucleoplasmic REC-818eller förekomsten av WAPL-119. WAPL-1 intensitet är störst i den somatiska gonad, hög i den perifera zonen, och låg under tidig meiotiska prophases19. Flera cellcykeln mätningar är möjliga med några variationer i protokollet: jag) identifiera kärnor i S-fas och mäta S-fas index; (II) identifiera kärnor i M-fas och mäta indexet M-fas; (III) avgöra om kärnor var i mitotiskt eller meiotiska S-fas; IV) mäta längden på G2; V) åtgärd duartion G2 + M + G1 faser; VI) mäta graden av meiotiska inresa. VII) uppskatta graden av meiotiska progression.
Man kan göra flera cellcykeln mätningar från endast ett fåtal typer av våt-lab experiment. Protokollet nedan beskriver en 30 min puls märkning av utfodring C. elegans vuxen hermafroditer med EdU märkt bakterier och samtidig märkning M-fas celler genom färgning med anti-pH3 antikropp och perifera zonen celler genom färgning med anti-WAPL-1 antikroppar. Endast förändring varaktigheten av EdU foder (steg 2,5), typ av antikroppar sysselsatt (steg 5), och analyser (steg 8,3) krävs för ytterligare mätningar.
Beredning av EdU-märkt bakterier (steg 1) är avgörande för detta protokoll, och den första punkten för felsökning. Vildtyp unga vuxna hermafroditer etikett mycket pålitligt i en 4 h EdU-puls, vilket gör detta till en användbar kontroll för varje ny omgång EdU-märkt bakterier. Dessutom kommer intakt EdU-märkt bakterier som anger tarmen (i äldre djur eller vissa svalget/grinder defekta mutanter) etikett med klick-kemi och visas som ljusa avlånga puncta i tarmen. En alternativ teknik för märkning hermafrod…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma till E. coli lager center för MG1693; Wormbase; Stadens Caenorhabditis genetik som finansieras av nationella institut för hälsa Office av infrastruktur forskningsprogram (P40OD010440) för stammar. Zach Pincus för statistisk rådgivning; Aiping Feng för reagenser. Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar och John Brenner för utbildning, rådgivning, stöd och bra diskussion; och de Kornfeld och Schedl labs för feedback på detta manuskript. Detta arbete stöds delvis av National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 till KK, R01 GM100756 till TS] och en National Science Foundation pre gemenskap [DGE-1143954 och DGE-1745038 till ZK]. National Institutes of Health varken National Science Foundation hade någon roll i utformningen av studien, insamling, analys och tolkning av data, eller skriftligen manuskriptet.
E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
petri dishes | 60 mm diameter | ||
Long glass Pasteur pipettes | |||
1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
Tips | |||
Serological pipettes | |||
500 mL Erlenmyer flask | |||
Aluminum foil | |||
25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
Borosilicate glass tubes 1ml | |||
glass slides | |||
no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
37 °C Shaker incubator | |||
Tabletop Centrifuge | |||
Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
Mini Centrifuge | |||
20 °C incubator | |||
4 °C refrigerator | |||
-20 °C freezer | |||
Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |