C. elegans Germline timidin Analog EdU ile hücre döngüsü analizi
Summary
Bir görüntüleme tabanlı yöntemi anlatılan S fazlı tanımlamak ve timidin kullanarak C. elegans hermafrodit germline hücre döngüsü dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir analog EdU. Bu yöntem yok transgenes gerektirir ve immünfloresan boyama ile uyumludur.
Abstract
Ökaryotlarda hücre döngüsü analizi sık kromozom morfolojisi, ifade ve/veya hücre döngüsünün çeşitli aşamalarında veya nükleozit analogları ve eklenmesi için gereken gene ürünlerin yerelleştirme kullanır. S-aşamasında DNA polimerazlar timidin analogları EdU veya BrdU gibi kromozom DNA analizi için hücreleri işaretleme, dahil. C. elegans, nükleozit analog EdU için solucanlar sırasında düzenli kültür besleniyor ve immünfloresan teknikleri ile uyumludur. C. elegans germline, şeffaf, genetik olarak facile, çünkü bu ve segregasyonun profaz ve hücresel farklılaşma/gametogenesis ortaya çıkan yollar, kök hücre, mayoz ve hücre döngüsü sinyal bir güçlü modeli etütler sistemdir bir Doğrusal derleme gibi moda. Bu özellikler EdU mitotically Bisiklete binme hücreleri ve germline geliştirme dinamik özellikleri çalışma için harika bir araç olun. Bu iletişim kuralı başarıyla EdU bakteri hazırlamak, onları vahşi-türü için yem açıklar C. elegans Hünsa, hermafrodit erbezi incelemek, EdU birleşme için içine DNA, leke leke çeşitli hücre döngüsü algılamak için antikorlar ile ve gelişimsel işaretleri, erbezi görüntü ve sonuçları çözümleyebilirsiniz. Protokol yöntemi ve S-faz Dizin, M-faz Dizin, G2 süresi, hücre döngüsü süresi, segregasyonun giriş oranı ve segregasyonun profaz progresyon oranı ölçümü için analysis değişimler açıklar. Bu yöntem hücre döngüsü veya hücre tarihinin diğer dokulara, aşamaları, genetik arka planlar ve fizyolojik şartlarda çalışmaya adapte edilebilir.
Introduction
Hayvan gelişmede, yüzlerce, binlerce, milyonlarca, milyarlarca veya hatta trilyonlarca hücre bölünmeler yetişkin organizma oluşturmak için gereklidir. Hücre döngüsü, G1 hücresel olaylar kümesi oluşur (gap), S (sentez), G2 (gap) ve M (mitoz) tanımlayan bir dizi olaylar yürütülen her hücre bölünmesi. Hücre döngüsü dinamik ve teknik olarak zor olabilir gerçek zamanlı olarak en iyi takdir. Bu protokol için sunulan teknikleri aşamaları ölçümleri ve hareketsiz görüntüler üzerinden hücre döngüsünün zamanlama yapmak izin.
5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) veya 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) gibi nükleozit analogları ile etiketleme S-faz hücre döngüsü dynamics Caenorhabditis elegans (C. elegans) Yetişkin çalışmalarda tanımlamak için altın standart olduğunu hermafrodit germline1,2,3,4,5. Onlar herhangi bir genetik yapı üzerinde güvenmeyin gibi EdU ve BrdU neredeyse herhangi bir genetik arka planda kullanılabilir. BrdU görüntülenmesi için sık sık işbirliği ile ek antikor boyama tarafından görüntülenmiştir diğer hücresel işaretleri değerlendirilmesi ile uyumsuz olan anti-BrdU antikor boyama, antijen ortaya çıkarmak için sert kimyasal tedavi gerektirir. Buna karşılık, EdU görselleştirme hafif koşullar altında tıklayın Kimya tarafından oluşur ve böylece ortak6,7boyama antikor ile uyumludur.
Çekirdek sadece timidin (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) analogları DNA’ya S-aşamasında dahil beri etiket özgüllük açıktır. Görselleştirme sabit dokusunda yer alır. EdU etiket başına bir azid içeren boya kadar görünmez veya fluorophore kovalent bakır katalize tıklayın Kimya8tarafından EdU, alkin ile tepki verir. EdU etiketleme çekirdeği maddelerinin etiketlenmesi kısa bir darbe kullanarak S-aşamasında olduğunuz hemen bilgi sağlayabilir. EdU da nabız-chase veya sürekli etiketleme kullanarak dinamik bilgi sağlayabilir; Örneğin, bir darbe-chase deneyinde etiket her hücre bölünmesi seyreltilmiş veya olarak nondividing hücreleri ilerleme geliştirilmesi yoluyla yayılır.
C. elegans hermafrodit germline sinyal yolları, kök hücre, mayoz ve hücre döngüsü, bir güçlü modeli için çalışmalar sistemidir. Yetişkin germline ardından giriş ve ilerleme daha proksimale gametogenesis aşamaları ile koordine segregasyonun profaz, (Şekil 1) aracılığıyla distal uçta bulunan kök hücreleriyle polarize bir montaj hattı var. Proksimal sonunda yumurta Olgun, ovulated ve döllenmiş ve embriyo rahim9,10,11‘ deki yönergeleri başlayabilirsiniz. ~ 20 cep-çapı uzun bölge mitotically Bisiklete binme germline kök, progenitor hücreler ve segregasyonun S fazlı hücreleri ama hücreleri segregasyonun profaz içerir, distal ucu hücre yakınındaki progenitör bölge2,4 denir , 9 , 12. hücre zarlarında distal germline çekirdekler arasında eksik ayrılık sağlar, ancak yaratıcı bölgesi hücreleri Mitotik hücre büyük ölçüde bağımsız olarak Bisiklete binme tabi. Medyan Mitotik hücre döngüsü süresinin Genç Yetişkin Hünsa germline progenitör bölge hücrelerinin ~6.5 h olduğunu; G1 aşamasıdır kısa ya da yok, ve sendika değil1,2,13görülmektedir. Germline kök hücre farklılaşması ile aslında doğrudan farklılaşma oluşur ve böylece transit yükseltecek bölümler4yoksun. Sırasında farklılaşma pachytene aşamasında, yaklaşık 4 5 çekirdeği yumurta oluşturacak değil ama bunun yerine geçmesi apoptosis, sitoplazmik içeriklerini gelişmekte olan oosit12,14 bağışlayarak hemşire hücreler olarak hareket , 15.
Nükleozit analogları ile S-aşamasında etiketleme hücreleri ek olarak bir hücre mitoz ve mayoz antikor boyama kullanarak tanımlayabilirsiniz. Mitoz çekirdeği anti-Fosfo-histon H3 immunoreactive (Ser10) (pH3 denir) antikor7,16. Mayoz çekirdeği anti-onu-3 antikor (segregasyonun kromozom eksen protein)17‘ ye immunoreactive. Çekirdeklerin progenitör bölgedeki hım-3, nucleoplasmic REC-818varlığı veya WAPL-119varlığı yokluğunda tarafından tespit edilebilir. WAPL-1 yoğunluğu en yüksek somatik erbezi progenitör bölge’de, yüksek ve düşük sırasında erken segregasyonun prophases19yaşında. Protokol, bazı farklılıklar nedeniyle birkaç hücre döngüsü ölçümleri mümkündür: Ben) çekirdeği S-aşamasında tanımlamak ve ölçmek S fazlı Dizin; II) tanımlamak çekirdeği M-aşamasında ve M-faz Dizin ölçmek; III) çekirdeği mitotik veya segregasyonun S-aşamada edildi olup olmadığını belirlemek; IV) G2 süresi ölçün; V) ölçümü duartion G2 + M + G1 aşamaları; VI) ölçümü segregasyonun giriş oranı; VII) segregasyonun ilerleme hızını tahmin ediyoruz.
Bir ıslak-laboratuvar deneyleri sadece birkaç tür birden çok hücre döngüsü ölçümleri yapabilirsiniz. Bakteri ve ortak etiketleme M fazlı hücreleri ile anti-WAPL-1 antikor boyama tarafından bölge hücreleri boyama anti-pH3 antikor ve yaratıcı tarafından etiketli EdU ile C. elegans yetişkin Hünsa besleyerek etiketleme bir 30 dk darbe aşağıdaki protokolünü açıklar. Tek yem EdU (adım 2.5), tipi antikorların süresi değişimler (adım 5) istihdam ve analizleri (adım 8.3) ek ölçümler için gereklidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı ve sorun giderme için ilk nokta EdU etiketli bakteri (adım 1) hazırlanması önemlidir. Vahşi tipli Genç Yetişkin Hünsa etiketinde çok güvenilir 4 h EdU-darbe, bu EdU etiketli bakteri yeni her toplu iş için kullanışlı bir denetimi yapma. Ayrıca, bağırsak (büyük hayvanlar veya belirli yutak/taşlama arızalı mutantlar) girin sağlam EdU etiketli bakteri tıklayın kimya ile etiket ve parlak dikdörtgen puncta gut olarak görünür. Hünsa etiketleme için alternatif bir teknik bir …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG1693 için E. coli stok merkezi için minnettarız; Wormbase; Ulusal kurumları, sağlık Office of araştırma altyapı programlar tarafından (P40OD010440) suşlar için finanse Caenorhabditis genetik Merkezi; Zach Pincus istatistiksel tavsiye için; Aiping Feng reaktifler için; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar ve John Brenner eğitim, danışmanlık, destek ve yardımcı tartışma; ve bu el yazması geri bildirimler Kornfeld ve Schedl labs. Bu eser kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen [R01 AG02656106A1 KK, R01 GM100756 TS için] ve bir Ulusal Bilim Vakfı HGUGM dostluk [DGE-1143954 ve DGE-1745038 ZK için]. Ne Ulusal Sağlık Enstitüleri ne de Ulusal Bilim Vakfı çalışma, toplanması, Analizi ve yorumu veri tasarım, ne de el yazması yazılı herhangi bir rolü vardı.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
Riferimenti
- Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).
- Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
- Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetica. 201 (9), 167-184 (2015).
- Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
- ThermoFisher. . Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).
- Pazdernik, N., Schedl, T. . Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).
- Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Biologia dello sviluppo. 49 (1), 200-219 (1976).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
- Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Biologia dello sviluppo. 308 (1), 206-221 (2007).
- Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetica. 208 (2), 745-762 (2018).
- Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).
- Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
- Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
- Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Biologia dello sviluppo. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
- Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
- Vos, K. . De Cell Counter Plugin. , (2015).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rasband, W. . ImageJ. , (2016).
- Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), 671-680 (2010).
- Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
- Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
- Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
- . . Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).
- Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).
