Vurdering af cellulært Stress og Inflammation i diskrete Oxytocin-secernerende hjernen kerner i Neonatal rotten før og efter første råmælk fodring

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at isolere hjernen kerner i neonatal rotte hjernen sammenholdt med første råmælk fodring. Denne teknik giver mulighed for undersøgelse af næringsstof insufficiens stress i hjernen som moduleres af enterocyte signalering.

Abstract

Målet med denne protokol er at isolere oxytocin-receptor rige hjernen kerner i neonatal hjernen, før og efter første råmælk fodring. Udtryk for proteiner kendt til at reagere på metabolisk stress blev målt i hjernen-kerner isolater ved hjælp af Western blotting. Dette blev gjort for at vurdere, om metabolisk stress-induceret næringsstof insufficiens i kroppen udløste neuronal stress. Vi har tidligere vist, at næringsstoffer insufficiens i nyfødte fremkalder metabolisk stress i tarmen. Derudover modulerer råmælk oxytocin cellulært stress respons, betændelse og autophagy markører i nyfødte rotte gut villi før og efter første foder. Signalering protein markører tilknyttet endoplasmatiske reticulum stress [ER anstandsdame bindende immunoglobulin protein (BiP), eukaryote oversættelse indledningen faktor 2A (eIF2a), og eIF2a kinase protein kinase Rasmussen (p-PKR)], samt to betændelse-signalering proteiner [nuclear factor-κB (NF-kB) og hæmmer κB (IkB)], blev målt i nyfødte hjernen kerner [kernen i den ensomme tarmkanalen (NTS), paraventricular kerne (PVN), supra-optik kernen (søn), cortex (CX), striatum kerner (STR), og mediale preoptic kernen (MPO)] før den første foder (unprimed af råmælk) og efter starten af sygepleje (primes af råmælk). Udtryk for BiP/GRP78 og p-eIF2a blev upregulated i unprimed og downregulated i PRIMES NTS væv. NF-kB blev bevaret (høj) i CX, STR og MPO cytoplasma, hvorimod NF-kB var lavere og uændret i NTS, PVN og søn i begge betingelser. Den kollektive BiP og p-eIF2 resultater er i overensstemmelse med en stressrespons. eIf2a var fosforyleret af dsRNA afhængig kinase (p-PKR) i søn, CX, STR og MPO. Men i NTS (og i mindre grad i PVN), eIf2a var fosforyleret af en anden kinase, generel kontrol nonderepressible-2 kinase (GCN2). De stress-modulerende mekanismer tidligere observeret i nyfødte gut enterocytes synes at blive spejlet i nogle OTR-rige hjerneregioner. NTS og PVN kan udnytte en anden fosforylering mekanisme (under næringsmangel) fra andre regioner og er refraktære over for virkningen af næringsstof insufficiens. Kollektivt, tyder disse data på, at hjernen svar til næringsstof insufficiens stress er opvejet af signalering fra colostrum-pulverlak enterocytes.

Introduction

I modsætning til vores forståelse af tidlige hjernens udvikling forekommer i løbet af dage-til-uger postpartum er relativt lidt kendt om utal af dynamiske forandringer i de første timer af livet i rotter. En central udfordring har været den lille størrelse af neonatal rotte hjernen og et krav om high-tech redskaber til at isolere diskrete hjerneregioner eller enkelte celler. Undersøgelser vurdere ofte gen transskription og ikke oversættelse^1,2, som ikke giver en fast forståelse af funktionelle niveauer af aktiverede signaling molekyler. Andre undersøge udtryk ved hjælp af Immunhistokemi reference hjernen regioner, som ikke tillader for kvantificering af udtryk niveau³. Ingen undersøgelse til dato har undersøgt aktivering af signalering veje tilknyttet rats’ første colostrum feed i diskrete hjerneregioner, som kræver hurtig isolation og offer og måling af protein udtryk og protein fosforylering ved hjælp af Western blotting. Mens hjernen microdissection udføres på ældre og større hjerner, har vi ikke identificeret reference udfører en ikke-encellede hjernen punch i en P0 hjerne. Dette paper præsenterer en protokol til at isolere begrænset regioner af neonatal hjernen ved hjælp af en forholdsvis lavteknologisk punch teknik og en Western blotting-procedure til at måle protein udtryk i relativt små prøver. Denne protokol kan være egnet til forskningsspørgsmål, der kræver vurdering af protein udtryk og posttranslationelle modifikationer (fx., fosforylering) i relativt begrænsede områder af små hjerner af enhver art, forudsat at den brugeren kan visuelt identificere området af hjernen af interesse med et atlas og identificerbare milepæle.

Denne teknik blev udviklet for at forstå forandringer i hjernen som følge af den neonatale rats’ første colostrum feed, som er rig på oxytocin (OT). OT har længe været kendt for sin evne til at stimulere mælk nedløb og uterin sammentrækning. Dog er OT nu kendt for at spille en bred vifte af roller i reguleringen af mange kropsfunktioner og adfærd⁴. For eksempel, OT modsætter sig stress og inflammation i forbindelse med adaptive affiliative adfærd⁵, forsinkelser, gastrisk tømning, og bremser intestinal transit. OT receptorer (OTR) er blevet identificeret i enteriske neuroner og intestinale epitel^6,7,8. Gastrointestinale virkningerne af OT er særligt vigtige for barnet i den tidlige postnatale periode. For eksempel, amning er forbundet med levering af betydelige mængder af OT til neonatal gut^9,10, og data viser, at OTR stærkt overexpressed i duodenal villi under mælken pattegris periode⁸.

In vitro- eksperimenter ved hjælp af en gut cellelinie har demonstreret på cellulært niveau at oxytocin modulerer vigtige molekyler i stress signalering vej^11,12 og en regulerende rolle i oversættelse af proteiner ¹². disse undersøgelser tyder på, at komponenterne i mælken, herunder eksogene oxytocin fra moderen, er vigtige i udfoldet protein respons i nyfødte at reducere cellulært stress¹³.

In vivo og ex vivo studier har vist, at colostrum OT modulerer cellulært stress respons, betændelse og autophagy markører i nyfødte rotte gut villi. Nyfødte enterocytes lider væsentlig cellulært stress på deres luminale side når tarmen er samtidig udsat for mikrobiota fra moderen i colostrum^14,15 og mange proteiner, herunder hormoner som OT^{9 , 10 , 16}.

OT indvirkning på hjernen har været undersøgt¹⁷. OT signaling mekanismer demonstreret i tarmen i de tidlige postnatale periode er imidlertid ikke blevet undersøgt i hjernen. I dette papir, er en metode til at isolere diskrete hjernen kerner i neonatal rotte hjernestammen og hypothalamus ved hjælp af elektroforese bruges til at profilere enkeltstående hjerneregioner. Det overordnede mål med denne metode er at fange tilstanden af celle signalering i hjernen områder så tæt som muligt til fødsel, før og efter den første mælk diegivning i hjernevæv med den laveste glial/neuronal indeks. Begrundelsen for udviklingen af denne teknik er at det giver mulighed for hurtige isolering af begrænset, mikroskopiske hjerneregioner i neonatal unger med en mere homogen samling af neuroner for ex vivo undersøgelser ved hjælp af en automatiseret Western blotting metode, giver særdeles ensartede resultater på forholdsvis små dissekeret prøver. En mangel ved forudgående arbejde omfatter mere grov dissektion (hjernen skiver eller hele hjernen) og ældre dyr^18,19. Hjerner af unge unger er utroligt dynamisk, featuring bølger af glial differentiering efter fødslen. For at studere ændringer i hjernen påvirket af pups’ første fodring, er studerer begrænset neuronal kerner med reproducerbare dissektion nødvendige.

Mælk foder er normalt analyseret for sit immunologiske og ernæringsmæssige indflydelse på helbred eller gene udtryk (eksempelvis i enterocytes^20,21), der henviser til, at dens virkning på hjernen områder under hjernens udvikling er sjældent undersøgt. Effekten af mælk transit i tarmen på hjernefunktion blev analyseret i forhold til gut cholecystokinin receptorer vagus relæ til hjernestammen kerner, men ikke til intracellulær signalering veje²². Der er en omfattende litteratur om sårbarhed af udvikle nyfødte hjernen til fejlernæring af mødre under graviditet²³, men stress og inflammation signalerne er ikke behandlet. Vigtigere er, udnytter den nuværende metode et fænomen i dag-nul rotte nyfødte, der isolerer blod-født colostrum stimuli fra vagus relæ af visceral stimuli. Dette er den såkaldte stress hypo-lydhørhed periode præget af umodne kernen tractus solitarius (NTS)-hypothalamus kredsløb umiddelbart efter fødslen^24,25 , som begrænser NTS, paraventricular kerne (PVN), og supraoptic kerne (søn) signaler til blod-født stimuli.

Denne metode er nyttig for analyse af flere signaling veje og begrænset relativt til neuronale celler, forudsat at hjernevæv er høstet på postnatal dag-0 i rotter, ud over om mødre er blevet anfægtet eller ikke af nogen form for behandling under graviditet. Kuld kan analyseres for virkningerne af colostrum feed versus pre fodring signalering. Når man sammenligner signaler mellem hjernen områder med fattige versus rig protein udbytte, denne metode gør det muligt i-kapillær bestemmelse af total protein af polypeptid bands i kapillærer løber parallelt med immun-kvantitering af protein antigener. Denne metode gør det muligt for kvantitativ sammenligning, ved hjælp af arbitrære enheder, af resultaterne af den samme antistof uden standard kvantitative kurver og med henvisning til total protein pr. kapillær. Sammenligne resultaterne af forskellige antistoffer er muligt, kun ved hjælp af kvantitative standard kurver.

Denne metode er tilladt for vurdering af tovejs signalering mellem tarmen og hjernen, og som kan påvirke funktion i begge organer²⁶. Association mellem indtag af oxytocin og fødevarer, som er blevet grundigt undersøgt i de seneste år²⁷, understøtter en sammenhæng mellem øget oxytocin signalering og næringsstoftilgængelighed. Disse undersøgelser støtter også begrebet converse energi underskud er kombineret med reduktioner i hypothalamus oxytocin signalering.

Tidligere undersøgelser af effekten af OT på hjerneaktivitet viste, at induceret gut betændelse fremkaldt økonomichefer transskription i hypothalamus PVN, amygdala og piriform cortex, som er refraktære over for vagotomy²⁸. Systemisk infusion af OT med sekretin faldt imidlertid hjernen økonomichefer svar på den provokeret betændelsesreaktion i gut²⁸. Dette foreslog, at effekten af eksogene OT blev udført af ruter end vagus relæer, eventuelt via blodbårne signaling molekyler transporteres gennem område postrema^6,29.

I denne undersøgelse, blev cellulært stress signaling veje, der har tidligere observeret i tarmen vurderet i hjernen. Hypotesen var at mælkebestanddele kan beskytte eller udskyde effekten af betændelse på gut permeabilitet til mikrobiel og andre metabolitter, og til gengæld effekter på hjernens funktion. De klare antagonistiske forskelle i IkB versus BiP signalering fundet i villi, før og efter priming af colostrum¹³, foreslog, at hjerner af nyfødte, stadig i færd med at udvikle, kan fornemme signalerne colostrum-induceret gut.

Signaling protein markører, der anvendes i tidligere gut eksperimenter, der er forbundet med endoplasmatiske reticulum stress blev målt. De omfatter ER anstandsdame BiP, oversættelse indledningen faktor eIF2a (som fungerer som en stress reaktion integrator³⁰), eIF2a kinase p-PKR, og to betændelse-signalering proteiner (NF-kB og dens inhibitor, IkB).

Seks hjerneregioner baseret på deres evne hos voksne udskiller eller besvare OT blev valgt. NTS, beliggende på den øvre medulla, er den første relæ af visceral input og modtager direkte signalering fra vagus sensoriske neuroner i tarmen³¹ og eventuelt blod-født cytokiner, toksiner og hormoner via den tilstødende område postrema³². PVN, supraoptic kerne (søn), striatum kerner (STR), hjernebarken (CX) og mediale preoptic kerne (MPO) modtager signaler fra tarmen via NTS.

Resultaterne viste, at den cellulære stressrespons i umiddelbar postnatale periode forud for colostrum priming og umiddelbart efter første fodring er forskellige i NTS i forhold til PVN og søn. Signalering i CX, afveg STR og MPO fra PVN og søn, så godt. Af OT vist tidligere at modulere cell stress og betændelse i tarmen særskilt beskyttende funktioner er sandsynligvis sanses af nogle områder af hjernen. Kollektivt, viser dataene, at på cellulært niveau, i de første timer efter fødslen, hjernen reagerer på metabolisk stress forbundet med næringsstoffer insufficiens. Dataene viser også, at omfang og retning af modulerende virkningerne af colostrum feed er region-afhængige og, i nogle regioner, de spejl OT effekter vist tidligere i tarmen.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg ved Columbia University og New York State psykiatriske Institute. 1. væv forberedelse Bestil timet gravide rotter fra kreditor. Følg timet gravide rotter ved at observere deres voksende underliv i ugerne efter deres ankomst og efterfølgende på udkig unger på den forventede leveringsdato ved inspektion af buret hver 2 h indtil levering begynder. Fjerne unger med behandskede hånd a…

Representative Results

De repræsentative bands af immunoreactivity i forhold til total protein viser, at der er hjernen kerner med meget lav høstede protein. Dette kræver brug af automatiserede vestlige skamplet teknik, som er meget følsomme i forhold til den kanoniske vestlige skamplet. Denne tilgang kan køres med fortyfold mindre protein pr. kapillær i forhold til pr. vognbane i Western blotting. Differential virkningerne af colostrum priming på…

Discussion

En teknik til microdissection af diskrete OTR-rige hjernen kerner i neonatal rotte hjernen er præsenteret i dette papir. Det er almindeligt anerkendt, at neuroner er højt specialiserede, selv inden for godt karakteriseret kerner i hjernen. Denne meget reproducerbare tilgang til at isolere bestemte OTR-rige kerner giver mulighed for robust hypotesetest. Ved hjælp af automatiserede Western blotting, blev konsistens og reproducerbarhed af resultaterne yderligere forbedret. Mens en begrænsning af denne teknik er fortsat …

Materials

Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50