3-डी सेल संस्कृति प्रणाली आक्रमण अध्ययन और मूत्राशय कैंसर में चिकित्सकीय मूल्यांकन के लिए
Summary
मूत्राशय कैंसर के आक्रमण शासी प्रक्रियाओं के लिए अवसरों का प्रतिनिधित्व करते है और चिकित्सकीय उपचारात्मक विकास । यहां हम एक मूत्राशय कैंसर आक्रमण मॉडल जो ट्यूमर spheroids, समय चूक इमेजिंग और फोकल माइक्रोस्कोप की 3 डी संस्कृति को शामिल वर्तमान । इस तकनीक इनवेसिव प्रक्रिया की सुविधाओं को परिभाषित करने के लिए और चिकित्सकीय एजेंटों स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है ।
Abstract
मूत्राशय कैंसर एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य समस्या है । यह अनुमान है कि अधिक से अधिक १६,००० लोगों को इस साल मर जाएगा संयुक्त राज्य अमेरिका में मूत्राशय कैंसर से । जबकि मूत्राशय कैंसर के ७५% गैर इनवेसिव और metastasize के लिए संभावना नहीं है, एक इनवेसिव विकास पैटर्न के बारे में 25% प्रगति । आक्रामक कैंसर के साथ रोगियों के आधे तक घातक मेटास्टेटिक पतन का विकास होगा । इस प्रकार, मूत्राशय के कैंसर में इनवेसिव प्रगति के तंत्र को समझने रोगी परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण है और घातक मेटास्टेसिस को रोकने के । इस अनुच्छेद में, हम एक त्रि-आयामी कैंसर आक्रमण मॉडल प्रस्तुत करते हैं जो ट्यूमर कोशिकाओं और stromal घटकों को शामिल करने के लिए vivo मूत्राशय ट्यूमर microenvironment में होने वाली स्थितियों में नकल करने की अनुमति देता है । इस मॉडल समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर वास्तविक समय में इनवेसिव प्रक्रिया का पालन करने का अवसर प्रदान करता है, आणविक मार्ग आक्रमण ब्लॉक करने के लिए क्षमता के साथ फोकल immunofluorescent इमेजिंग और स्क्रीन यौगिकों का उपयोग शामिल पूछताछ. हालांकि इस प्रोटोकॉल मूत्राशय कैंसर पर केंद्रित है, यह संभावना है कि इसी तरह के तरीकों के लिए अंय ट्यूमर प्रकार में आक्रमण और गतिशीलता की जांच के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
आक्रमण कैंसर प्रगति में एक महत्वपूर्ण कदम है, जो मेटास्टेसिस के लिए आवश्यक है, और कम जीवित रहने और रोगियों में गरीब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है । मानव मूत्राशय के कैंसर में, जो दुनिया भर में प्रति वर्ष १६५,००० मौतों के बारे में कारण बनता है मूत्र पथ का सबसे आम द्रोह, कैंसर चरण, उपचार और रोग का निदान सीधे उपस्थिति या1आक्रमण की अनुपस्थिति से संबंधित हैं । मूत्राशय कैंसर के मामलों के ७५% के आसपास गैर मांसपेशी इनवेसिव रहे है और स्थानीय लकीर के साथ प्रबंधित कर रहे हैं । इसके विपरीत, स्नायु-इनवेसिव मूत्राशय कैंसर (सभी मामलों के बारे में 25%) उच्च मेटास्टेटिक दरों के साथ आक्रामक ट्यूमर हैं और आक्रामक multimodality थेरेपी2,3के साथ इलाज कर रहे हैं । इसलिए, आणविक रास्ते को समझने कि आक्रमण ट्रिगर बेहतर इनवेसिव प्रगति के जोखिम को चिह्नित करने के लिए और चिकित्सकीय हस्तक्षेप जो आक्रामक प्रगति को रोकने कर सकते हैं विकसित करने के लिए आवश्यक है ।
ट्यूमर इनवेसिव प्रगति एक जटिल तीन आयामी (3 डी) वातावरण में होता है और अन्य ट्यूमर कोशिकाओं, स्ट्रोमा, तहखाने झिल्ली, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं, fibroblasts, मांसपेशी कोशिकाओं और संवहनी सहित कोशिकाओं के अन्य प्रकार के साथ ट्यूमर सेल बातचीत शामिल है endothelial कक्ष । पारगंय समर्थन (जैसे, Transwell) परख प्रणालियों सामांयतः quantitate कैंसर सेल4आक्रमण करने के लिए कार्यरत हैं, लेकिन इन प्रणालियों सीमित है क्योंकि वे वास्तविक समय में आक्रमण की प्रक्रिया की सूक्ष्म निगरानी की अनुमति नहीं है और आगे धुंधला और आणविक विश्लेषण के लिए नमूनों की पुनर्प्राप्ति चुनौतीपूर्ण है । एक 3-डी मूत्राशय ट्यूमर अंडाकार आकृति प्रणाली के विकास के आक्रमण का अध्ययन वांछनीय है क्योंकि यह इन विट्रो प्रणालियों में की सुविधा के साथ परिभाषित microenvironmental घटकों के शामिल करने की अनुमति देता है ।
इस प्रोटोकॉल में, हम एक प्रणाली का वर्णन करने के लिए मानव मूत्राशय कैंसर एक 3-डी अंडाकार आकृति आक्रमण परख कोलेजन शामिल का उपयोग कर कोशिकाओं के इनवेसिव प्रक्रियाओं पूछताछ आधारित जेल मैट्रिक्स और फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए जांचकर्ताओं को सेल गतिशीलता पर नजर रखने की अनुमति और वास्तविक समय में आक्रमण (चित्रा 1ए) । इस प्रणाली बहुमुखी है और विभिन्न stromal/ट्यूमर सेटिंग्स पूछताछ करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । यह सबसे मूत्राशय कैंसर कोशिका लाइनों या प्राथमिक मूत्राशय ट्यूमर और अतिरिक्त stromal कोशिकाओं को शामिल कर सकते है जैसे कैंसर से जुड़े fibroblasts और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को5,6,7। इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक प्रकार से बना मैट्रिक्स-1 कोलेजन, लेकिन ऐसे fibronectin, laminin, या अंय कोलेजन प्रोटीन के रूप में अंय अणुओं को शामिल संशोधित किया जा सकता है । इनवेसिव प्रक्रियाओं के लिए पीछा किया जा सकता है ७२ ज या अब माइक्रोस्कोप और प्रणाली का इस्तेमाल किया की क्षमता पर निर्भर करता है । निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस 3 में एंबेडेड ट्यूमर के दाग-डी मैट्रिक्स से पहले, के दौरान, और उसके बाद आक्रमण की अनुमति देता है प्रोटीन की पूछताछ इनवेसिव कोशिकाओं में विनियमित, इस प्रकार महत्वपूर्ण जानकारी है कि आम तौर पर अनुपस्थित या इकट्ठा करने के लिए मुश्किल प्रदान अंय 3-डी संस्कृति मॉडल का उपयोग करना । इस प्रणाली को भी स्क्रीन यौगिकों जो आक्रमण ब्लॉक करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, और संकेत चित्रित ऐसे यौगिकों से प्रभावित रास्ते ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम एक 3-डी ट्यूमर अंडाकार आकृति मॉडल है कि मूत्राशय के कैंसर के आक्रमण की वास्तविक समय अवलोकन जो कैंसर प्रगति और मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है की अनुमति देता है का वर्णन । इस प्रणाली के लिए विभि?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों तकनीकी सहायता के लिए डॉ हावर्ड क्रॉफर्ड (मिशिगन विश्वविद्यालय) की प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा और इस अध्ययन के लिए सामग्री और उपकरण उपलब्ध कराने, और तकनीकी सहायता के लिए एलन Kelleher ।
यह काम मिशिगन विश्वविद्यालय के Rogel कैंसर सेंटर कोर ग्रांट CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (डीएमएस) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
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