Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica
Summary
I processi che governano l’invasione della vescica cancro rappresentano opportunità di biomarcatore e sviluppo terapeutico. Qui vi presentiamo un modello di invasione del cancro della vescica che incorpora 3-d cultura di sferoidi di tumore, time-lapse imaging e microscopia confocale. Questa tecnica è utile per definire le caratteristiche del processo invasivo e per lo screening di agenti terapeutici.
Abstract
Cancro alla vescica è un problema significativo per la salute. Si stima che più di 16.000 persone moriranno quest’anno negli Stati Uniti dal cancro alla vescica. Mentre il 75% dei cancri alla vescica sono non-invasivo e rischiano di riprodurrsi per metastasi, circa il 25% progredire ad un modello di crescita dilagante. Fino a metà dei pazienti con i tumori invasivi si svilupperà letale ricaduta metastatica. Così, la comprensione del meccanismo della progressione invasiva nel cancro alla vescica è fondamentale prevedere gli esiti dei pazienti e prevenire le metastasi letale. In questo articolo, presentiamo un modello di invasione del tridimensionale che permette l’incorporazione delle cellule del tumore e componenti stromal di imitare in vivo le condizioni che si verificano nel microambiente del tumore della vescica. Questo modello offre l’opportunità di osservare il processo invasivo in tempo reale usando la formazione immagine di time-lapse, interrogare le vie molecolari coinvolte utilizzando composti immunofluorescenti confocal di formazione immagine e schermo con il potenziale di invasione di blocco. Mentre questo protocollo si concentra sul cancro della vescica, è probabile che simili metodi potrebbero essere utilizzati per esaminare l’invasione e la motilità in altri tipi di tumore.
Introduction
L’invasione è un passaggio fondamentale nella progressione del cancro, che è richiesto per la metastasi ed è associata con la bassa sopravvivenza e prognosi in pazienti. Nel cancro alla vescica umano, la neoplasia più comune dell’apparato urinario che provoca circa 165.000 morti all’anno in tutto il mondo, la fase di cancro, il trattamento e la prognosi sono direttamente correlati alla presenza o all’assenza di invasione1. Circa il 75% dei casi di cancro alla vescica sono non muscolo-invasivo e sono gestiti con resezione locale. Al contrario, i tumori della vescica muscolo-invasivo (circa il 25% dei casi) sono tumori aggressivi con gli alti tassi metastatici e sono trattati con terapia aggressiva di multimodality2,3. Di conseguenza, capire le vie molecolari che attivano l’invasione è essenziale per caratterizzare meglio il rischio di progressione invasiva e sviluppare interventi terapeutici che possono impedire la progressione invasiva.
Progressione invasiva del tumore si verifica in un ambiente complesso tridimensionale (3D) e comporta l’interazione delle cellule del tumore con altre cellule del tumore, stroma, membrana basale e altri tipi di cellule compreso le cellule immuni, fibroblasti, cellule muscolari e vascolari cellule endoteliali. Supporto permeabile (ad es., Transwell) sistemi di dosaggio sono comunemente impiegati per quantificare il cancro delle cellule invasione4, ma questi sistemi sono limitati perché non consentono al microscopio di monitoraggio del processo di invasione in tempo reale e la recupero dei campioni per ulteriori macchiatura e l’analisi molecolare è impegnativo. Sviluppo di un sistema di sferoide di tumore della vescica 3D per studiare invasione è auspicabile perché permette l’incorporazione di componenti microambientali definiti con la convenienza di sistemi in vitro .
In questo protocollo, descriviamo un sistema per interrogare i processi invasivi delle cellule di cancro alla vescica umano usando un’analisi di invasione di sferoide 3D che incorporano le matrici gel a base di collagene e microscopia confocale per consentire ai ricercatori di monitorare la motilità cellulare e invasione in tempo reale (Figura 1A). Questo sistema è versatile e può essere modificato per interrogare le varie impostazioni/tumore stromal. E ‘ possibile incorporare la maggior parte delle linee cellulari di cancro della vescica o tumori della vescica primario e altre cellule stromal come cancro associato fibroblasti e cellule del sistema immunitario5,6,7. Questo protocollo descrive una matrice composta da collagene di tipo 1, ma può essere modificato per incorporare altre molecole quali fibronectina, laminina o altre proteine di collagene. Processi invasivi possono essere seguiti per 72 h o più a seconda della capacità del sistema utilizzato e microscopio. Fissazione e colorazione di immunofluorescenza del tumore incorporato nella matrice 3D, prima, durante e dopo l’invasione permette l’interrogatorio di sovraregolati proteine in cellule invasive, fornendo così informazioni cruciali che solitamente assenti o difficili da raccogliere utilizzo di altri modelli 3-d cultura. Questo sistema può essere utilizzato anche per composti di schermo che bloccano l’invasione e delineare vie di segnalazione colpite da tali composti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un modello di sferoide di tumore 3D che permette l’osservazione in tempo reale di invasione di cancro della vescica, che è critica per metastasi e progressione del cancro. Questo sistema è favorevole all’incorporazione di varie componenti stromal e cellulare per consentire ai ricercatori di riepilogo meglio il microambiente del tessuto dove si svolge l’invasione del cancro della vescica. Sferoidi di cancro della vescica possono essere generati da varie fonti quali linee cellulari (compreso linee cellula…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare il laboratorio del Dr. Howard Crawford (Università del Michigan) per supporto tecnico e fornire materiali e attrezzature per questo studio e Alan Kelleher per il supporto tecnico.
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dalla University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), bè YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
Riferimenti
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