3-D клетки культуры системы для изучения вторжения и оценки терапии рака мочевого пузыря
Summary
Процессы, регулирующие вторжения рака мочевого пузыря представляют возможности для биомаркеров и терапевтические развития. Здесь мы представляем модели вторжения рака мочевого пузыря, которая включает 3-D культуры сфероидов опухоли, покадровой изображений и confocal микроскопии. Этот метод полезен для определения особенностей процесса инвазивных и скрининг терапевтических агентов.
Abstract
Рак мочевого пузыря является проблемой значительного здравоохранения. Предполагается, что более чем 16.000 человек умрет в этом году в Соединенных Штатах от рака мочевого пузыря. В то время как 75% рака мочевого пузыря, неинвазивная и вряд ли могут метастазировать, около 25% прогресс для инвазивного роста. До половины пациентов с инвазивным раком будет развивать смертоносного метастатического рецидива. Таким образом понимание механизма инвазивных прогрессии рака мочевого пузыря имеет решающее значение для прогнозировать исходы и предотвращения смертоносных метастазов. В этой статье мы представляем трехмерной рака вторжения модель, которая позволяет включение опухолевых клеток и стромы компонентов для имитации условий в vivo происходящих в микроокружения опухоли мочевого пузыря. Эта модель обеспечивает возможность наблюдать инвазивных процесс в режиме реального времени с использованием промежуток времени визуализации, допрашивать молекулярные пути, связанные с помощью конфокальной immunofluorescent изображений и экран соединений с потенциалом для блока вторжения. Хотя этот протокол фокусируется на рак мочевого пузыря, вполне вероятно, что подобные методы могут использоваться для изучения вторжения и подвижности в других типов опухолей, а также.
Introduction
Вторжение является важнейшим шагом в прогрессии рака, который необходим для метастазов и связан с нижней выживания и плохим прогнозом у больных. В человеческой мочевого пузыря рак, наиболее распространенных злокачественных мочевых путей, которое вызывает около 165 000 смертей в год во всем мире, непосредственно связаны с наличие или отсутствие вторжения1стадия рака, лечение и прогноз. Около 75% случаев рака мочевого пузыря мышц инвазивных и являются управляемые с местными резекции. Напротив неинвазивного мышц мочевого пузыря рак (около 25% всех случаев) являются агрессивные опухоли с высокой метастатических и обрабатываются с агрессивным мультимодальность терапии2,3. Таким образом важно понимание того молекулярные пути, которые вызывают вторжения лучше характеризуют риска инвазивного прогрессии и разработать терапевтические вмешательства, которые могут предотвратить инвазивное прогрессии.
Инвазивные прогрессии опухоли происходит в среде сложной трехмерной (3-D) и включает в себя взаимодействие клеток опухоли с другие опухолевые клетки, строма, базальной мембраны и других типов клеток, в том числе иммунных клеток, фибробластов, мышечных клеток и сосудов эндотелиальные клетки. Проницаемых поддержки (например, Transwell) анализа систем обычно используются, чтобы quantitate раковых клеток вторжения4, но эти системы ограничены, потому что они не позволяют микроскопических мониторинг процесса вторжения в режиме реального времени и получение образцов для дальнейшего окрашивания и молекулярный анализ является сложной задачей. Разработка системы сфероида опухоли 3-D мочевого пузыря для изучения вторжения желательно, потому что она позволяет включение определенных microenvironmental компонентов с удобством в vitro системах.
В этом протоколе, мы описать систему допросить инвазивных процессов человека пузыря раковых клеток с помощью пробирного вторжения 3-D сфероида, включающих матрицы геля на основе коллагена и confocal микроскопии позволяет следователям для мониторинга клетки моторики и вторжение в режиме реального времени (рис. 1А). Эта система является универсальным и может быть изменено для допроса различных стромальные опухоли/параметры. Это может включать большинство линий клеток рака мочевого пузыря или опухоли мочевого пузыря первичных и дополнительных стромальные клетки, таких, как рак, связанные фибробластов и иммунные клетки5,6,7. Этот протокол описывает матрицы состоит из коллагена типа-1, но может быть изменен для включения других молекул, например, фибронектин, Ламинин или других белков коллагена. Инвазивных процессов может следовать за 72 ч или больше в зависимости от возможности микроскопа и используемой системы. Фиксация и иммунофлюоресценции окрашивание опухоли, встроенные в матрице 3-D до, во время и после вторжения позволяет допроса upregulated белков в инвазивных клеток, обеспечивая тем самым важную информацию, которая обычно отсутствует или собрать трудно использование других моделей 3-D культуры. Эта система также может использоваться для экрана соединений, которые блокируют вторжение и разграничить сигнальных путей, пострадавших от таких соединений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем 3-D опухоли сфероида модель, которая позволяет в реальном времени наблюдения вторжения рака мочевого пузыря, которая имеет решающее значение для прогрессии рака и метастаз. Эта система поддается включение различных стромы и клеточных компонентов разрешить следовате…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить лаборатории д-р Ховард Кроуфорд (Мичиганский университет) для технической поддержки и предоставление материалов и оборудования для этого исследования и Алан Kelleher для технической поддержки.
Эта работа финансировалась грантов из университета Мичигана с Рак центр Core Грант CA046592-26S3, низ K08 CA201335-01A1 (ПЛП), BCAN YIA (ПЛП), низ R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
Riferimenti
- American Cancer Society. . The Society. , (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Ricerca sul cancro. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).
