ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
O9-1 — линия клеток нейронные крест Multipotent с мышью. Здесь мы описываем подробные пошаговые протоколы для культивирования клеток O9-1, дифференциации клеток O9-1 в типы конкретных клеток и генетически манипулировать O9-1 клетки с помощью малых интерферирующих РНК опосредованной нокдаун или изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9.
Abstract
Гребень нервной клетки (СЧД) переносятся Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые могут дифференцироваться в различных типов клеток и порождают множественные тканей и органов. O9-1 клеточная линия является производным от эндогенных мыши эмбриональные СЧД и поддерживает его multipotency. Однако в условиях конкретной культуры, O9-1 клетки могут дифференцироваться в различных типов клеток и использоваться в широком диапазоне исследований приложений. Недавно с сочетанием мыши и исследований клеток O9-1, мы показали, что бегемот, сигнальные пути эффекторов яп и таз играют важную роль в нейронные крест производные краниофациальных развития. Хотя процесс культивирования клеток O9-1 является более сложной, чем для других клеточных линий, O9-1 клеточная линия представляет собой мощный модель для изучения СЧД в пробирке. Здесь мы представляем собой протокол для культивирования клеток линии O9-1 для поддержания его stemness, а также протоколы для дифференциации клеток O9-1 в различных типов клеток, таких как гладких мышечных клеток и остеобластов. Кроме того описываются протоколы для выполнения исследования потери функции генов в клетках O9-1 с помощью удаления ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и малые интерферирующие РНК опосредованной нокдаун.
Introduction
Гребень нервной клетки (СЧД) являются Multipotent с экстрактами стволовых как клетки с замечательным миграционной способности и переходных существование во время эмбрионального развития. СЧД происходят между поверхности эктодермы и нервной трубки и мигрировать в другие районы эмбриона во время эмбрионального развития1. Основываясь на их функциональные домены, СЧД можно разделить на несколько различных типов, в том числе черепа, ствол, вагусной, сакральный и сердца СЧД. Кроме того СЧД могут дифференцироваться в несколько линий клеток, например, гладкомышечные клетки, костные клетки и нейроны и привести к возникновению различных тканей2,3. Развитие СЧД характеризуется сложной серии морфогенетических событий, которые настроены на различных молекулярных сигналов. Учитывая сложные регулирование СЧД и их важный вклад в многочисленные структуры, регуляции NCC развития часто может привести к врожденных врожденных дефектов, которые составляют около 30% всех человеческих врожденных врожденных дефектов. Аномалии в ходе разработки нейронные крест может привести к заячья губа/неба, недостатки формирования носа, синдромы, дефекты например дефектных сердца отток тракта, или даже младенческой смертности1,4,5, 6 , 7. понимание молекулярных механизмов развития НСС имеет важное значение для разработки методов лечения заболеваний, вызванных дефектами в развитии НКК. С использованием различных in vitro и in vivo подходы8,9,10,11,12,13,14 ,15, был достигнут значительный прогресс в исследованиях НКК. В естественных условиях, животных моделей, в том числе кур, земноводных, данио рерио и мышей, использовались для изучения СЧД1. Кроме того человеческие эмбрионы были использованы для изучения процесса миграции НКК в начале развития эмбриона человека16. В пробирке, ячейки модели для СЧД, таких как человека СЧД, которые возникли от пациента подкожной жировой клетчатки, использовались для изучения болезни Паркинсона17. NCC O9-1 линия, которая была первоначально производным от массовой культуры эндогенного СЧД, изолированных от зародышей мыши E8.518, является мощным ячеечная модель для изучения СЧД. Важно отметить, что в условиях культуры-дифференцируя, клетки O9-1 Multipotent с экстрактами стволовых как СЧД. Однако в условиях разной культуры O9-1 клетки могут быть продифференцированы в типы уважаемого клеток, таких как гладкомышечные клетки, остеобласты, хондроцитов и глиальных клеток18. Учитывая эти свойства, клетки O9-1 широко использовались для исследований, касающихся NCC, например расследование молекулярный механизм черепно лицевых дефектов19,20.
Здесь предоставляются подробные протоколы для поддержания клеток O9-1, дифференцируя O9-1 клеток в различных типов клеток и манипулирования O9-1 клетки, выполняя исследования потери функции гена с ТРИФОСФАТЫ-Cas9 изменения генома и малые интерферирующие РНК (siRNA)- при посредничестве нокдаун технологий. В качестве примера представитель описано использование клеток O9-1 для изучения яп и таз -из функция потерь. Вниз по течению эффекторов Бегемот, сигнальный путь, который играет важную роль в клеточной пролиферации, дифференциация и апоптоз YAP и таз. Бегемот путь также было показано важное значение в развитии и гомеостаза нескольких различных тканей и органов, а также в патогенезе различных заболеваний20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Основные компоненты Бегемот сигнализации включают опухоли подавитель стерильные 20-как киназы Mst1/2, WW домена содержащих Сальвадор эшафот белков и большие опухолевые супрессоры гомолога (Lats1/2) киназы. Бегемот сигнализации препятствует яп и таз активности и способствует их деградации в цитоплазме. Без репрессий бегемота яп и таз можно перемещать в ядрах и функционировать как транскрипционный анализ совместного активаторы. Мы недавно показали, что конкретно инактивации Бегемот сигнализации эффекторов яп и таз в мыши СЧД, используя Wnt1КРР и Wnt1Cre2SOR водителей привело к эмбриональной летальность в E10.5 с тяжелыми краниофациальных дефектов20. Мы также выполняются исследования с использованием клеток O9-1 для изучения роли Yap и таз в СЧД. Для изучения функции Yap и таз в НКК распространения и дифференциации, яп и таз нокдаун клетки были созданы в клетках O9-1 с помощью малых интерферирующих РНК, и яп нокаут клетки были созданы с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9. Те же стратегии потери функции гена могут применяться для различных целевых генов в другие пути. Кроме того получить из функция исследования и анализы transfection может применяться также к клеткам O9-1 для изучения функции гена и регулирования. Протоколы, описанные здесь, предназначены для использования следователями в качестве руководства для культивирования клеток O9-1 для поддержания Multipotent с stemness, для дифференциации клеток O9-1 в другие типы клеток в условиях разных культур и для изучения функции гена и молекулярные механизмы СЧД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка перед O9-1 клеточная культура
Примечание: Базальной носители культуры клеток O9-1 должны было обусловлено Sandos инбредных мышей тиогуанин/Уабаин устойчивые (STO) фибробластов клетки мыши; Таким образом STO клетки должны быть получены и подготовлен как описано ниже, перед началом O9-1 клеточной культуры.
-
Культура клетки активные STO
- Подготовить СМИ для культивирования активные клетки сто, делая полный Дульбекко изменение орла СМИ (DMEM) с 7% плода бычьим сывороточным (ФБС) (эмбриональных стволовых клеток культуры сорт), 100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мм L-глютамин (окончательный концентрации указаны).
Примечание: STO средних используется для выращивания активной ячейки едока STO. Пенициллин, стрептомицин и L-глютамин могут образовывать осадков в хранилище; Растворите полностью закупорить перед использованием. - Слой плиты культуры клеток стандартный 100 мм с желатином 0,1% для 30 мин при комнатной температуре. После инкубационного периода аспирационная дополнительных желатина. Используйте пластину сразу же после покрытия.
Примечание: в качестве альтернативы, крышка с STO СМИ и оставить пластину в увлажненные инкубатор, чтобы избежать высыхания плиты (это означало только для краткосрочного хранения, а не для хранения ветротурбин пластины). - Оттепель STO клетки быстро в ванну воды 37 ° C; Протрите cryovial с 70% этанол до открытия и немедленно перевести весь флакон клеток в пластиковых пробирок.
- Добавить медиа STO каплям пластиковых пробирок; отношение объема клетки к средствам массовой информации составляет 1:10.
- Центрифуга клетки на 180 x g 3 мин на RT.
- Смешайте нежный закупорить и передачи клетки к пластине с покрытием желатина.
- Разрешить STO клетки, чтобы расти в течение 24 ч в стандартной инкубатора (37 ° C, 5% CO2).
- Изменение среды (только после того, как клетки присоединиться) 24 ч после посева и утилизируйте старые среднего.
- Проверьте STO клетки каждый день под микроскопом и проход на 80% confluency.
- Перед началом STO клеток пассированый, пальто плит с 0,1% желатина (желатина объем равен половина роста объема средств массовой информации для этого судна) за 30 мин при комнатной температуре.
- Для прохода STO клетки, аспирационная питательных сред и вымыть клетки с фосфат амортизированное saline (PBS) дважды (добавить PBS, равным объемом питательных сред).
- Аспирационная PBS и добавить 0,25% трипсина ЭДТА (регулировка громкости в зависимости от размера судна); затем инкубации при 37 ° C за 5 мин.
Примечание: Для 100 мм пластины, используйте 10 мл средства роста и 3 мл раствора трипсина. Для 150 мм пластины используйте 20 мл средства роста и 8 мл раствора трипсина. Объем буфера мытья равен объем роста средств массовой информации. - Инактивирует трипсина с равным объемом сто средств массовой информации. Семя STO ячейки новые пластины с коэффициентом от 1:3 до 1:10.
Примечание: Общее расширение схемы является расширение от одного cryovial в один 100 мм пластины, а затем одна пластина 150 мм, затем четыре 150 мм пластин и наконец до 16 пластин 150 мм.
- Подготовить СМИ для культивирования активные клетки сто, делая полный Дульбекко изменение орла СМИ (DMEM) с 7% плода бычьим сывороточным (ФБС) (эмбриональных стволовых клеток культуры сорт), 100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мм L-глютамин (окончательный концентрации указаны).
-
Инактивация и замораживание клеток STO
- Для приготовления 2 x замораживания средств массовой информации, добавьте следующее к сто СМИ (окончательный концентрации указаны): 20% FBS, 20% диметилсульфоксида (ДМСО).
- После смешивания, фильтр стерилизовать 2 x замораживания средств массовой информации (поры размер 0,22 мкм) и хранить его на 4 ° C до использования. Сделайте 2 x замораживания средств массовой информации в тот же день использования и Выбросьте неиспользованные замораживания средств массовой информации.
- Готовят раствор митомицин C в PBS на концентрации 0.5 мг/мл. Чтобы растворить митомицин C в PBS, лента бутылку на Вортекс и вихрь на низком настройки для приблизительно 45 минут для полного растворения частицы.
Примечание: Митомицин C светло-чувствительной и трудно растворить.
Предупреждение: Митомицин C остро токсичен и может вызвать рак. Обрабатывать только с надлежащего личного защитного оборудования. - Инактивирует STO клетки путем добавления конечной концентрации 0,01 мг/мл митомицин C существующих средств массовой информации. Проинкубируйте втечение 2 ч внутри Стандартный инкубатора (37 ° C, 5% CO2).
- Мыть тарелки (150 мм) с 20 мл PBS дважды после дезактивации с митомицин C.
- Аспирационная решение PBS, разбить ячейки с помощью 8 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 5 мин внутри Стандартный увлажненные инкубатора (37 ° C, 5% CO2).
- Инактивирует трипсина с 8 мл сто средств массовой информации.
- Передача решения ячейки для пластиковых пробирок. Объедините более чем одной пластины в одном пластиковых пробирок для экономии времени. Центрифуги для 5 мин при 180 x g.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл PBS.
- Использование 10 мкл раствора ячейки для подсчета клеток с помощью Горяева. Подсчитать ячейки в сетке площади и умножить число, полученное путем 104 , чтобы определить количество клеток в 1 мл. Граф дважды и в среднем двух чисел для получения окончательной оценки числа клеток на миллилитр.
- Центрифуга клетки для 5 мин при 180 x g.
- Аспирационная PBS и добавить 1:1 (по объему) сто средств массовой информации и 2 x заморозки клеток Пелле. Отрегулируйте громкость для окончательного ячейки концентрации 4 х 106 клеток/мл (эта сумма является хорошо для одной пластины 100 мм).
Примечание: К примеру, от четырех 150-мм пластин, давая в общей сложности 60 x 106 клеток, заморозить 4 x 106 клеток / cryovial, с каждой cryovial, содержащие 1 мл раствора клеток. Четыре пластины доходность около 15 криопробирки (60/4 = 15). Добавьте 7,5 мл STO СМИ и 7,5 мл 2 x замораживания средств массовой информации клетки Пелле, Ресуспензируйте и Алиготе 1 мл в каждом cryovial. - Ресуспензируйте, медленно закупорить замораживания средств массовой информации с Пелле ячейки. Передача 1 мл раствора ячейки для каждого cryovial и маркировать соответствующим образом.
- Место криопробирки внутри закрытой крышкой из пенополистирола коробки (это обеспечивает медленный скорость охлаждения, которая улучшает выживаемость клеток). Переведите поле морозильник-80 ° C в течение 24 часов перед передачей cryovial жидкого азота.
Примечание: Для достижения наилучших результатов, свести к минимуму клеток подсчета времени, а также время между добавлением 2 x замораживания средств массовой информации к клеткам и передачи флаконы-80 ° C.
2. O9-1 клеточная культура
- Подготовить базальной СМИ для культуры клеток O9-1, добавив следующее в среде DMEM (окончательный концентрации указаны): 15% FBS, 0,1 мм минимум основных СМИ (MEM) заменимые аминокислоты, пируват натрия 1 мм, 55 мм бета меркаптоэтанол 100 ед/мл пенициллин, 100 ед/мл стрептомицин, 2 мм L-глютамином, 103 единиц/мл лейкемия ингибирующего фактора (LIF; добавил непосредственно перед использованием, не добавляйте в складе бутылку) и 25 нг/мл фибробластический фактор роста основные (bFGF; добавил непосредственно перед использованием, не добавляйте в складе бутылка).
- Фильтр стерилизовать базальной СМИ (поры размер 0,22 мкм) и заверните в фольгу для защиты от света.
-
Соберите с кондиционерами базальной СМИ из инактивированных STO клеток.
Примечание: Приступить только после получения инактивированных STO клетки. O9-1 базальных СМИ, собранных от STO сотовый плит далее именуемые как кондиционером базальной СМИ.- Оттепель инактивированная STO клетки быстро, как описано выше (один cryovial, содержащих 4 х 106 клеток хорошо для одной 100 мм пластины и дает примерно 100 мл кондиционером базальной СМИ после 10 дней сбора). Семя инактивированная STO клетки к пластине желатин покрытием с помощью сто средств массовой информации. Позволяют клеткам прикрепить на ночь в стандартной увлажненные инкубатора (37 ° C, 5% CO2).
- 24 ч после отогрева клетки сто, отказаться от существующих средств массовой информации сто и замените базальной средств массовой информации.
Примечание: Не добавляйте LIF и bFGF инактивированных STO клетки культуры блюда; только добавьте к блюдам культуры клеток O9-1. - Каждые 24 ч, изменение средств массовой информации с помощью базальной СМИ O9-1 и собирать базальной СМИ от STO сотовый плит в бутылку. Оберните флакон, содержащий кондиционером базальной СМИ в фольгу для защиты от света. Хранить все собранные средства массовой информации при 4 ° C.
Примечание: Потому что клетки были инактивированная, они могут не выглядеть так здоров, как они это делали после нескольких дней сбора; Это следовало ожидать. - При необходимости проверить на загрязнение, соберите базальной средств массовой информации для каждой коллекции день в разных трубок (вместо одной бутылки), завернутый в фольгу. С помощью 24-ну плита, место 1 мл СМИ от каждый день в каждой скважине и инкубировать на ночь в стандартной инкубатор для проверки бактериального загрязнения под микроскопом.
Примечание: Средства массовой информации остается красный цвет, если не загрязнение, но изменения в желтый при наличии бактериального загрязнения. - После сбора кондиционером базальной СМИ на 10 дней, отбросить STO клетки. Комбинат (если применимо) все собранные условного базальной СМИ и фильтрации стерилизации (поры размер 0,22 мкм) в стерильных бутылку. Оберните бутылку в фольгу для защиты от света. Держите фильтрующий кондиционером базальной при 4 ° C для максимум один месяц с даты фильтра.
3. поддержание клеток O9-1
Примечание: Работа O9-1 базальных СМИ является фильтр стерилизованное кондиционером базальной СМИ, в которых Лиф (конечная концентрация 103 единиц/мл) и bFGF (конечная концентрация 25 нг/мл) добавляются непосредственно в клетки культуры блюдо перед использованием. Этот носитель должен быть защищен от света и хранить при 4 ° C.
-
Восстановление клеток O9-1
- Медленно оттепели запасов бутылка базальной мембраны матрицы (например, Matrigel) на ночь при 4 ° C подготовить аликвоты.
- Добавьте 5 мл DMEM с 10% FBS до 5 мл запасов базальной мембраны матрицы мембраны. Смешайте хорошо закупорить с холодной наконечники хранятся при температуре-20 ° C. Держите оригинальный флакон и Алиготе трубы на льду. Заморозить аликвоты в разных томах (0,5 мл или 1 мл аликвоты) в зависимости от потребностей эксперимент. Избегайте замораживания оттаивания базальной мембраны матрица несколько раз.
Примечание: базальной мембраны матрица polymerizes быстро при комнатной температуре; Использование холодной наконечники и держать трубы холодной при работе во избежание непреднамеренного полимеризации. - Оттепель Алиготе базальной мембраны матрицы на 4 ° C или на льду 2 ч до начала эксперимента. Не храните матрица на 4 ° C на длительное время.
- Использовать фильтр стерилизации DMEM с 10% FBS разбавлять базальной мембраны матрицы до конечной концентрации 0.5 мг/мл для покрытия плит. Слой пластины с матрицей базальной мембраны (0.5 мг/мл) при комнатной температуре в течение 1 ч. Убедитесь, что она полностью покрывает пластины (как показано на рис. 1).
- Наклона пластины, когда аспирационных базальной мембраны матрицы не прикасайтесь к поверхности с покрытием; сухие пластины при 37 ° C за 30 мин. Не чрезмерно сухие пластины с покрытием.
Примечание: Действовать, только когда все средства массовой информации и реагенты готовы к использованию (кондиционером базальной СМИ, стерильной фильтрации 10% FBS в среде DMEM, LIF и bFGF). - Быстро восстановить клетки O9-1, поставив cryovial в ванну воды 37 ° C; медленно вихрем флакона до решения полностью превращается в жидкость и немедленно приступить к следующему шагу.
- Передать все решения клеток от cryovial (примерно 1 мл) 15 мл пластиковых пробирок. Добавить 5 томов DMEM с 10% FBS (фильтр стерилизованное с размером поры фильтра 0.22 мкм) и Ресуспензируйте.
- Центрифуги для 3 мин при 180 x g. Аспирационная супернатант не нарушая Пелле ячейки. Ресуспензируйте ячейки Пелле (нажав) в кондиционерами базальной СМИ, дополненная LIF и bFGF. Подсчет ячеек с помощью Горяева.
Примечание: Кондиционером базальной СМИ, дополненная LIF и bFGF имеет решающее значение для поддержания multipotency клеточной линии O9-1. Использование уход добавить правильные средства массовой информации, чтобы избежать непреднамеренного клеточная дифференцировка. - Семя клетки от 10 000 до 15 000 клеток/см2 пластины 6-хорошо. Позволяют клеткам для присоединения и расти в инкубатор культуры стандартной ячейки (37 ° C, 5% CO2) на ночь, перед изменением СМИ.
- Убедитесь, что клетки прикрепляются прежде чем изменить СМИ (прилагаемый здоровые клетки выглядят как те, показано на рисунке 2).
- Всегда измените культуру СМИ на следующий день после восстановления клеток O9-1 (использовать кондиционерами базальной СМИ дополнены с LIF и bFGF).
-
Прохождение клеток O9-1
- Когда клетки O9-1 достигают 80% confluency, оттепель матрице базальной мембраны и подготовить матрицы покрытием плиты базальной мембраны, как описано выше. Добавьте кондиционером базальной СМИ, дополненная LIF и bFGF на судно. Кроме того добавьте DMEM без FBS держать базальной мембраны матрица от высыхания и хранить внутри Стандартный увлажненные инкубатор для не более чем 3 дней.
- Промойте O9-1-содержащих скважин (6-ну Латы) 2 мл Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) дважды и аккуратно Пипетка, чтобы избежать потери клеток.
- Разбить ячейки с 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА при 37 ° C для нейтрализации трипсина 3 мин с равным количеством DMEM с 10% FBS. Неоднократно Пипетка жидкости по всей поверхности хорошо отмежеваться столько клетки от пластины как можно.
Примечание: Концентрация трипсина составляет 0,05% вместо 0,25%. Используйте DPBS для разбавления от запасов бутылки. - Избегайте генерации пузыри, когда отделения клетки от пластины.
- Передача всех клеток решение для пластиковых пробирок и центрифуги для 3 мин при 180 x g. Аспирационная супернатант не нарушая Пелле ячейки. Ресуспензируйте Пелле клеток в пластиковых пробирок, нежный дозирование в кондиционерами базальной СМИ, дополненная LIF и bFGF.
- Используйте Горяева для подсчета числа общей ячейки как описано выше. Семя клетки (10000 до 15000 клеток/см2) покрытием плиты, подготовленных как описано в шагах 3.1.4 для 3.1.8. Один хорошо пластины 6-ну потребует 100000 клеток семян.
- Позволяют клеткам для присоединения и расти в инкубатор культуры стандартной ячейки (37 ° C, 5% CO2). Всегда измените культуру СМИ на следующий день после пассированый O9-1 клетки.
-
Замораживание клеток O9-1
- Готовить 2 x замораживания средств массовой информации для клеток O9-1, разбавленных в среде DMEM следующее (окончательный концентрации указаны): 40% FBS и 20% ДМСО.
- Фильтр стерилизовать 2 x замораживания средств массовой информации и держать его на 4 ° C. 2 x замораживания средств массовой информации должны производиться на тот день, когда он используется. Отменить все неиспользуемые замораживания средств массовой информации.
Примечание: Заморозить O9-1 клетки на 80% confluency. - Промыть скважин с DPBS дважды; Пипетка осторожно, чтобы не потерять клеток.
- Разбить ячейки с 0,05% трипсина ЭДТА при 37 ° C на 3 мин, а затем нейтрализовать трипсина с равным количеством 10% FBS в среде DMEM. Неоднократно Пипетка жидкости по всей поверхности хорошо отмежеваться столько клетки от пластины как можно.
- Передать все пластины содержимое трубки центрифуги и центрифуги для 3 мин при 180 x g. Аспирационная супернатант и добавить 2 мл PBS и Ресуспензируйте путем выстукивать.
- Использование 10 мкл раствора ячейки для подсчета клеток с помощью Горяева, как описано выше.
- Центрифуга клеток решение для 3 мин при 180 x g. Аспирационная супернатант и отрегулировать количество базальной СМИ необходимо; Затем добавьте равное количество 2 x замораживания средств массовой информации.
Примечание: Клетки замораживаются в концентрации 1 х 106 клеток/мл (1 мл на cryovial). - Передать криопробирки клетки и маркировать соответствующим образом. Место криопробирки внутри крышкой из пенополистирола коробки для медленной скорости охлаждения при температуре-80 ° C для по крайней мере 24 часа до перевода в жидкий азот.
Примечание: Для достижения наилучших результатов, свести к минимуму клеток, считая и время между добавлением 2 x замораживания средств массовой информации и передачи флаконы-80 ° C.
4. манипуляция клеток O9-1
-
Выполнение нокдаун малых интерферирующих РНК в клетках O9-1
- Оттепель и пальто 24-ну плита с базальной мембраны матрицы, как описано выше (шаги 3.1.4–3.1.8) до начала эксперимента. Восстановить и семян O9-1 клетки, что позволяет им расти до 60% до 80% confluency.
- Разбавьте липосомы в сыворотке свободных СМИ согласно соответствующим хорошо тома. Разбавьте малых интерферирующих РНК в сыворотке свободных СМИ в финал. Добавьте разбавленные siRNA разреженных липосомы в соотношении, рекомендованные производителем. Смешайте хорошо закупорить и инкубировать.
Примечание: Следуйте руководство изготовителя на тома, время и температуры инкубации. - Добавьте соответствующий объем малых интерферирующих РНК липидного комплекса в ячейки в соответствии с рекомендациями изготовителя.
- Инкубируйте клетки для 24 h в инкубатор культуры стандартной ячейки (37 ° C, 5% CO2). Вниз по течению выполните как соответствующие (экстракт РНК, белков экстракта, окрашивание, и т.д.)
Примечание: нокдаун раз siRNA и концентрации могут варьироваться в зависимости от индивидуальных эксперимент.
-
Выполнение Нокаут гена в клетках O9-1 с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9
Примечание: Обратитесь к ранее опубликованным протокол для использования ТРИФОСФАТЫ-Cas9 в mammalian клетки линии29. Условии вот Упрощённое описание изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и соответствующие шаги.- Получите sgRNA последовательностей с помощью средства разработки sgRNA.
- Перевязать sgRNA к pSpCas9 (bb) - 2а - GFP вектор30.
- Transfect клетки O9-1 с вектором с использованием стандартного липофекция протокола согласно рекомендациям изготовителя.
- Инкубируйте клетки в инкубатор культуры стандартной ячейки при 37 ° C с 5% CO2 на 24 часа.
- Выполните, активируемых флуоресценции клеток сортируя (FACS) на основании GFP/7-AAD. Семя GFP + отдельные ячейки в 96-луночных пластины.
- Рост клеток в инкубаторе для дополнительного 4 дней. Отменить все скважины, которые имеют более одной колонии.
- Выполните ПЦР с праймерами, предназначенных для обнаружения удаления. После ПЦР Запуск продуктов ПЦР на геле агарозы для оценки размера группы. Проверка нокаут эффективность достигнута с помощью ТРИФОСФАТЫ-Cas9 editingby, выполняя Западный blotting (на рисунке 3приведен пример результатов Yap нокаут).
5. O9-1 клеточная дифференцировка
-
Дифференцировка клеток O9-1 в остеобласты
- Подготовить Остеогенные дифференциация СМИ, разбавленных в альфа MEM следующее (окончательный концентрации указаны): дексаметазона 0,1 мм, 100 нг/мл костный морфогенетический белок 2 (БМП2), аскорбиновая кислота 50 мкг/мл, 10 мм b метронидазол, 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл.
- Обнаружить маркер остеобластов, остеокальцин, дифференцированной остеобластов, иммуноокрашивания, как показано на рисунке 4.
Примечание: Остеогенные дифференциация также могут оцениваться с помощью других маркеров остеобластов или с ализарин красный пятнать или щелочной фосфатазы пятнать.
-
Дифференцировка клеток O9-1 в хрящевые клетки
- Подготовить СМИ дифференциацию хондроцитов, разбавленных в альфа MEM следующее (окончательный концентрации указаны): 5% плода телячьей сыворотки (FCS), 1% инсулина трансферрина селен (СТС), 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мг/мл, 10 нг/мл преобразования фактор роста бета (TGF-b3), аскорбиновая кислота 50 мг/мл, 10 нг/мл БМП2, дексаметазона 0,1 мм и пируват натрия 1 мм.
- Первые культуры в монослое O9-1 клетки с Остеогенные СМИ для 3 дней и затем trypsinize и культура в формате micromass в СМИ дифференциацию хондроцитов еще 7 дней.
- Дифференциация хондрогенном ослов с Альциановый синий пятнать или маркеры хондроцитов.
-
Дифференцировка клеток O9-1 в гладкомышечные клетки
- Подготовить СМИ дифференцировки клеток гладких мышц, разбавленных в среде DMEM следующее (окончательный концентрации указаны): 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл и 10% FBS.
- Дифференцировки клеток гладких мышц ослов с иммунофлюоресценции, окрашивание с помощью антител против маркеры гладких мышечных клеток, таких как актин гладких мышц (SMA), показано в качестве примера на рисунке 5.
-
Дифференцировка клеток O9-1 в глиальных клеток
- Подготовить глиальных клеток дифференциация СМИ, разбавленных в среде DMEM/F12 следующее (окончательный концентрации указаны): 1 x B-27 дополнение, 2 мм L-глютамином, 50 нг/мл БМП2, 100 ед/мл пенициллин, 100 мг/мл стрептомицина, LIF 50 нг/мл и 1% тепло инактивированная FBS.
- Оцените глиальных клеток, выполняя иммунофлюоресценции, окрашивание с антителами против глиальных клеток маркеры, такие как белок, связывающий жирные кислоты 7 (FABP7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель наших нокдаун и нокаут экспериментов было изучение последствий яп и таз -из функция потерь в клетках O9-1. До бросовым и нокаут эксперименты мы должны убедиться, что подготовиться к базальной СМИ и культуры O9-1 клетки как описано выше (например, базальной мембраны матрицы необходимо охватить целую тарелку, как показано на рисунке 1и клетки O9-1 оправился из жидкого азота как показано на рис. 2). Мы провели нокдаун экспериментов, как описано выше в которых яп и таз одновременно сбили. Равное количество Yap siRNA и таз siRNA были добавлены в конечный объем, рекомендованные производителем. Для управления пластины был добавлен равным объемом nontargeting siRNA.
Yap-null линия клетки O9-1 был создан путем удаления экзона 3 Yap с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 генома редактирования, как описано в Wang et al. 20. Мы провели эксперименты нокаут с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9, как описано выше и в Wang et al. 20. Мы использовали следующие sgRNA последовательности, которые бокам экзона 3 Yap: 5 ' caccgtggattacgtgggtatgtt-3′ (sgRNA1-вперед), 5 ' aaacaacatacccacgtaatccac-3′ (sgRNA1-реверс), 5 ' caccgagatggtctaatgtagtga-3′ (sgRNA2-вперед), 5 ' - aaactcactacattagaccatctc-3′ (sgRNA2-реверс)
CACC была добавлена стренги вперед, и AAAC был добавлен в обратном strand. G был добавлен на 5' конца стренги вперед, потому что oligo не начинаются с G, и C был добавлен к 3' конца стренги обратный. Во время редактирования шаги, описанные выше и Wang et al. генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9 20, клетки были в кондиционерами базальной СМИ для клеток O9-1 дополнена LIF и bFGF, чтобы избежать нежелательных дифференциации. Следующие праймеры PCR были использованы для обнаружения удаления Yap : 5 ' AAAACAGTCTCCACTACCCCTT-3′ (вперед) и 5 ' GGCCATCATAGATCCTGGACG-3′ (реверс). SgRNAs позиция мыши хромосоме 9 от базового #7973399 в #7974433. PCR праймер на хромосоме позиция от базового #7973306 в #7974478. После ПЦР группа ПЦР для яп нокаут с экзона удалены 3 появилась как группа 138-bp на геле агарозы; одичал тип Yap появился как группа 1173-ВР. Эффективность Yap нокаут с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9 была проверена с Западный blotting, как показано на рисунке 3.
Как описано выше, O9-1 клетки может быть культивировали в конкретных дифференциация заставить СМИ содействовать дифференциации в конкретной ячейке типы. Оценка дифференцировки может быть сделано с помощью различных подходов, таких как Количественная ПЦР или иммуноокрашивания маркеров определенных ячеек. В качестве примера, на рисунке 4 показано O9-1 клетки, которые культивировали в остеобластов побуждение средств массовой информации и дифференцированной в остеобластов, которые были оценены клетками иммуноокрашивания с антителами против остеокальцин (Ocn, маркер остеобластов). В сочетании с нокдаун гена и нокаут эксперименты, описанные выше O9-1 клетки могут широко использоваться для исследования функции гена и фенотипические анализы. Например, оба одичал тип и яп-null O9-1 клетки были культивировали в гладкомышечные клетки дифференциация СМИ и оценены иммуноокрашивания клетки с антителами против актина гладких мышц (SMA, маркер клеток гладких мышц). Большинство клеток O9-1 одичал тип породило SMA-положительных клеток гладких мышц (Рисунок 5A), тогда как яп-null O9-1 клетки не дифференцироваться в SMA-положительных клеток гладких мышц (Рисунок 5B), которые указали, что ПЕА играет важную роль в дифференциации СЧД в гладкомышечные клетки.
Рисунок 1: Matrigel полностью пластина 35 mm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: O9-1 клетки 24 ч после восстановления от жидкого азота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Западная помарка данных показаны эффективные нокаут (ko) штата яп в клетках O9-1 с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9. WT: одичал типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: иммунофлюоресценции окрашивание остеобластов маркер остеокальцин (Ocn) указанием что O9-1 клетки порождает остеобластов клеток условиях дифференциации Остеогенные. Клетки окрашивали остеобластов маркер Ocn антитела (зеленый), и ядер окрашивали DAPI (синий). Стрелки указывают Ocn положительных клеток. Остеокальцин (Ocn, маркер остеобластов); DAPI (′, 6-diamidino-2-phenylindole). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Иммунофлюоресценции окрашивание актина гладких мышц (SMA), указав, что, условиях дифференциации клеток гладких мышц, большинство одичал тип O9-1 клеток дало повод для гладких мышечных клеток (A), тогда как яп-null O9-1 клетки не удалось дифференцироваться в гладкомышечные клетки (B). Клетки окрашивали SMA антитела (красный), и ядер окрашивали DAPI (синий). Стрелки указывают SMA-положительных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
НКК является универсальным и ключевой вклад различных тканей и органов во время эмбрионального морфогенеза. O9-1 клеточная линия ведет свой потенциал, чтобы дифференцироваться в много различных типов клеток и имитирует в vivo характеристики СЧД, что делает его полезным в vitro инструмент для изучения функции гена и молекулярных регулирование в СЧД. Различные состояния O9-1 клетки могут соответствовать разные нейронные крест потомства в естественных условиях, в зависимости от условий культуры клеток O9-1. O9-1 клетки могут поддерживаться Multipotent с состояние, когда культивированный условиях-дифференцируя культуры, аналогичные регулярные стволовых клеток культуры. Клетки-дифференцируя O9-1 могут соответствовать pre-migratory и мигрирующих Multipotent с экстрактами стволовых как СЧД в естественных условиях. Кроме того O9-1 клетки могут дифференцироваться в много различных типов клеток в условиях конкретных дифференциация культуры, которая является важным преимуществом для изучения функции гена и регулирование во время дифференциация СЧД от Multipotent с экстрактами стволовых клетки в тип конкретных дифференцированных клеток. Дифференцирования клетки O9-1 могут соответствовать post-migratory нейронные крест потомства в естественных условиях, которые имеют разные ячейки судьба дифференцироваться в различные типы клеток. В зависимости от исследовательский интерес O9-1 клетки можно манипулировать и по-разному культивированный дополнения в vivo NCC исследований на животных моделях.
Существуют различные способы, чтобы манипулировать O9-1 клетки для изучения NCC событий, включая гена функция потерь и получить из функции. Здесь представлены примеры, в котором siRNA сногсшибательно и ТРИФОСФАТЫ-Cas 9 гена редактирования эксперименты были проведены в клетках O9-1 для бегемота путь эффекторных Yap потери функции исследования20. С комбинированного использования мыши модель и O9-1 клетки наши исследования указали, что Yap играет важнейшую роль в регулировании распространения НКК и дифференцировку в гладкомышечные клетки20. Другие исследования в различных моделях также указали, что важную роль для Yap Yap СЧД. был показан для мыши нейронные крест гладких мышц дифференциация31 и повышения человеческого NCC судьба и миграции32. Кроме того Yap выражается во время раннего развития Xenopus 33. Эффективность нокдаун гена и нокаут в клетках O9-1, в сочетании с удобством выполняя другие течению молекулярные методы, такие как Количественная ПЦР (ПЦР), западных blotting и иммуноокрашивания поддерживает, что линия клетки O9-1 является отличным NCC модель, которая может быть легко манипулировать в пробирке. Помимо потери функции исследования мы описали выше и ранее20, различные другие приложения O9-1 клеток были описаны для изучения СЧД. O9-1 клетки могут быть использованы в качестве эффективной альтернативы для экспериментов, которые требуют относительно большое количество ткани, например иммунопреципитации chromatin виртуализации (чип seq). Однако многие в естественных условиях клетки события, такие как NCC миграции полагаться на сложных взаимодействий ткани и ткани, поэтому остается неясным, насколько хорошо O9-1 клетки могут точно имитировать в естественных условиях миграции НКК. Из-за ограничений в vitro исследования с клетками O9-1 рекомендуется проверить замечания, сделанные с O9-1 клетки в естественных условиях с использованием животных моделей.
При использовании линии клеток O9-1 для изучения СЧД в пробирке, поддержание multipotency клеток во время рутинной культура имеет решающее значение. Multipotency клетки O9-1 может быть проверена в начале культуры оценки выражения NCC маркерных генов как AP-2a и Sox9. Аналогично способность дифференциации клеток O9-1 может быть проверена их дифференциации в типы конкретных клеток. Чтобы избежать нежелательных дифференциации в ходе рутинной культивирования клеток O9-1, экспериментальной процедуры должны осуществляться в соответствии с установленным Протоколом, описанных здесь. Тщательная подготовка кондиционером базальной СМИ и свежие добавлением правильной концентрации LIF и bFGF имеют решающее значение для поддержания multipotency клеток O9-1. Кроме того экспериментальный график необходимо тщательно планировать, учитывая, что культивирование клеток O9-1 требует сначала готовит неактивные фидер STO клетки и сборе кондиционером базальной СМИ, которая хороша для только около месяца. Предыдущие исследования показали, что подвал мембрана матрица имеет важное значение для поддержания дифференциация потенциал клеток нейронной прекурсоров и мышц, а также мезенхимальные стволовые клетки34,35,36. В контексте протокола, описанные здесь базальной мембраны матрица обеспечивает платформу для клетки O9-1, чтобы присоединить и помогает поддерживать потенциал дифференциации. Таким образом матрица базальной мембраны является одним из важных факторов, которые могут повлиять на результаты эксперимента и их последовательность при повторении. Мы рекомендуем, подготовке базальной мембраны матрицы строго согласно Протоколу описанные выше и избегая несколько циклов замораживания оттаивания базальной мембраны матрицы. Кроме того при восстановлении O9-1 клетки из замороженного состояния к культуре, процесс перемещения клетки из жидкого азота в ванну воды 37 ° C необходимо сделать быстро, избегая любых vortexing в течение всего процесса. Кроме того разрастание клеток O9-1 также необходимо избегать поддерживать multipotency клеток O9-1. Когда пассированый O9-1 клетки, убедитесь, что концентрация трипсина разбавляется до 0,05% вместо 0,25% и что клетки появляются правильно отделить. Неоднократно закупорить очень осторожно для достижения одной ячейки подвеска необходим для избежания агрегированных клеток. В общем весь процесс обработки O9-1 клеточная линия необходимо сделать аккуратно и осторожно.
Таким образом, линия клетки O9-1 является весьма полезным инструментом для изучения СЧД в пробирке, особенно когда используется как метод дополняет в vivo исследований клеток СЧД. O9-1 имеют очевидные преимущества, такие как легкость, с которой они могут быть доступны и легкость с достаточно ячейки можно получить номера для экспериментов. Учитывая возможности дифференцировки клеток O9-1, они имеют большой потенциал для использования в широком диапазоне применений в различных областях исследований. O9-1 клетки может быть удобно использовать для приложений, таких как быстрый наркотиков тестирования и скрининга, чип seq, Транспозаза доступны хроматина с высокой пропускной способностью последовательности (ATAC-seq) и последовательность РНК (РНК-Seq), Джин получить из функция и функция потерь исследования, а также сигнальный регулирования исследований. Использование стандартизированных и полного протокола для обработки клеток O9-1 будет способствовать воспроизводимости исследований, в которых они используются.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Николь ШТАНСЕЛЬ, Ph.D., ELS, научных публикаций в институте сердца Texas, условии редакционной поддержки. Мы также благодарим следующие источники финансирования: Американской ассоциации сердца Национальный центр ученый развития Грант (14SDG19840000 J. Wang), 2014 Лоуренс исследования награда от Rolanette и Berdon Лоуренс кости болезни программа Техас (J. Wang ) и национальных институтов здравоохранения (DE026561 и DE025873 J. Wang, DE016320 и DE019650 на р. Maxson).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
Penicillin - streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100Xx | Gibco | 11140-050 | |
Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
Opti-MEM I (1x) | Gibco | 31985-070 | |
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
FCS (fetal calf serum) | |||
ITS (insulin-transferrin-selenium) | |||
TGF-b3 | |||
Ascorbic acid | |||
BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
Dexamethasone | |||
B-27 supplement |
References
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
- Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
- Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
- Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
- Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
- Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
- Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
- Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
- Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
- Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
- Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
- Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
- Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
- Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
- Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
- Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
- Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
- Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
- Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
- Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
- Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
- Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).
Tags
Генетика выпуск 140 ТРИФОСФАТЫ Cas9 O9-1 клетки нокаут гена генов нокдаун гребень нейронные клеткиErratum
Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.