قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

Summary

هنا يصف لنا تحليل القائم على الأسفار الفائق تدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة من خلال تحليلات فلوروميتريك والتصوير في الخلايا الحية. يمكن استخدام هذا الفحص لفحص المخدرات أو الجينات المستهدفة التي تنظم إعادة ختم غشاء البلازما في خلايا الثدييات.

Abstract

في بيئتهم الفسيولوجية، كثيرا ما تتعرض خلايا الثدييات الإجهادات الميكانيكية والكيميائية الحيوية التي تؤدي إلى تلف غشاء البلازما. واستجابة لهذه الأضرار، ختم الأجهزة الجزيئية المعقدة سرعة غشاء البلازما لاستعادة وظيفتها الحاجز والمحافظة على بقاء الخلية. 60 عاماً بحوث في هذا الميدان، وعلى الرغم من أننا لا تزال تفتقر إلى فهم شامل للخلية إعادة ختم الجهاز. أن عنصر التحكم إعادة ختم غشاء البلازما أو الأدوية التي يمكن تحسين إعادة ختم، وقد وضعنا الفائق تحليل القائم على الأسفار أن التدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات بهدف تحديد المكونات الخلوية مثقف في ميكروبلاتيس. كنظام نموذجي للضرر غشاء البلازما، تتعرض الخلايا إلى ليستيريوليسين السم البكتيري تشكيل المسام س (LLO)، الذي يشكل كبير 30-50 نانومتر القطر البروتينية المسام في المحتوية على نسبة الكولسترول في الدم الأغشية. يسمح استخدام قارئ الميكروسكوبية المتعدد وضع التحكم في درجة الحرارة لقياسات سبيكتروفلوروميتريك السريع والحساسة في تركيبة مع برايتفيلد والأسفار التصوير المجهري للخلايا الحية. التحليل الحركي لشدة الأسفار المنبعثة من فلوروتشرومي الحمض النووي ملزم إيمبيرمينت غشاء يعكس مدى الغشاء مما أدى إلى إصابة وإعادة ختم على مستوى السكان الخلية، مما يتيح لحساب الخلية إعادة ختم الكفاءة . تصوير مجهرية fluorescence يسمح لتعداد الخلايا، تعبر عن حلما فلورسنت من 2B هيستون البروتين النووي، في كل بئر الميكروسكوبية لمراعاة الاختلافات المحتملة في العدد من مؤثرا ويسمح في نهاية المطاف تحديد هوية السكان خلية متميزة. هذا التحليل الفائق هو أداة قوية يتوقع توسيع فهمنا لآليات إصلاح الغشاء عن طريق فحص الجينات المضيف أو مناشئ إضافة المركبات التي تحكم غشاء البلازما إعادة ختم.

Introduction

وتخضع خلايا الثدييات الإجهاد الميكانيكي وناضح والبيوكيميائية، أدى إلى فقدان سلامة غشاء البلازما. دون إعادة ختم سريعة وفعالة، أن تستسلم الخلايا التالفة بسرعة حتى الموت المبرمجة أو نخرية. منذ الستينات، وكان الدافع وراء الجهود الرامية إلى فهم غشاء البلازما إعادة ختم عملية بالعواقب المدمرة المرتبطة الخلل. في الواقع، قد تم ربط إصلاح غشاء البلازما ناقصة بسبب الطفرات في dysferlin ترميز الجينات، وإنتاج متقدمة glycation المنتجات النهائية، والعيوب في أمراض مثل ضمور العضلات أطرافهم-حزام، والسكري، ومتلازمة Higashi شيدياك منظم CHS1، على التوالي^1،2،،من^34،،من⁵⁶الليزوزومية من الاتجار بالبشر. ومع ذلك، حتى الآن، أن فهمنا للغشاء إعادة ختم هو ما زالت محدودة⁷. وقد أثبتت الدراسات الأولية أن إعادة ختم الغشاء يتم تهيئتها بواسطة تدفق خارج الخلية Ca^{2 +} من خلال غشاء البلازما التالفة^8،،من⁹¹⁰. ومنذ ذلك الحين، عدة غير التبادلية Ca^{2 +}-تعتمد آليات قد اقترحت إعادة ختم الخلايا. وتقترح فرضية التصحيح أن حويصلات داخل الخلايا بالقرب من الجرح، تلتحم مع بعضها البعض وغشاء البلازما التالفة بمثابة تصحيح^11،12،،من¹³¹⁴. نموذج ثاني يقترح أن الرقابة تعتمد على الكالسيوم من lysosomes في الجرح إصدارات موقع سفينجوميليناسي حمض الإنزيمات الليزوزومية، الذي يحول سفينجوميلين إلى السيراميد في النشرة الخارجي من غشاء البلازما. يؤدي هذا التغيير المفاجئ في تكوين الدهن يحركها السيراميد الالتقام المنطقة التالفة^15،،من¹⁶¹⁷. وأخيراً، تنطوي الآلية المقترحة ثالث دور اندوسومال الفرز المعقدة اللازمة للنقل (اسكرت) لتشجيع تشكيل حويصلات المواجه للخارج أن برعم قبالة من غشاء البلازما¹⁸. حدد فقط مجموعة محدودة من البروتينات في هذه النماذج، ويجب كذلك توضيح آلياتها.

هنا يصف لنا مقايسة الفائق الذي توسط التدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات ملتصقة تعرض للتلف المؤتلف ليستيريوليسين س (LLO)¹⁹. LLO السم تشكيل المسام (بفت) يفرزها الممرض داخل الخلايا اختياري الليستريه المستوحدة^20،،من²¹²² وينتمي إلى مكف/مركز السيطرة على الأمراض (مجمع الهجوم غشاء، بيرفورين، و فوق عائلة سيتوليسين تعتمد على نسبة الكولسترول في الدم). ماكبف تشكيل المسام الثدييات التي تنتجها البروتينات المشاركة في الدفاعات المناعية، بينما المؤلفان السموم البكتيرية أساسا إيجابية العوامل الممرضة التي تضر بالخلايا المضيفة النهوض أنماط الحياة الممرضة²³. يتم توليف المؤلفان مونومرات للذوبان في الماء أو dimers التي تربط الكولسترول الموجودة في غشاء البلازما، وأوليجوميريزي إلى مجمع بربري من وحدات فرعية تصل إلى 50. ثم يعيد ترتيب بربري المعقدة لإدراج β-خيوط عبر بلير الدهن، تشكيل مسام بيتا للبرميل الذي يمتد 30-50 نانومتر في قطرها^24،25،،من²⁶²⁷.  هذه المسام كبيرة تسمح بتدفق الأيونات والمكونات الخلوية الصغيرة داخل وخارج الخلية؛ رغم ذلك، وقد اقترحت بعض الدراسات أن مسام أصغر حجماً هي أيضا شكلت^28،،من²⁹³⁰. بين المؤلفان، يعرض LLO خصائص فريدة من نوعها، بما في ذلك التجميع تعتمد درجة الحموضة ودرجة الحرارة لا رجعة فيه، مما يفضي إلى تحليلات الفائق^31،32. يمكن إضافة LLO إلى مستنبت الخلية في 4 ˚C، درجة حرارة متساهلة إلى ملزمة لها للخلايا، ولكن ليس إلى تشكيل المسام المعقدة. ثم يمكن أن تكون متزامنة الشروع في تشكيل المسام برفع درجة الحرارة إلى 37 ˚C، مما يسمح لنشر فعالة من الجزيئات السمية في طائرة الغشاء بشكل ليغومرات ويعيد البناء كونفورماشونال المشاركة في توليد المسام. ولذلك، يلي رمز التبديل في درجة الحرارة، والحركية لتلف الخلايا يعتمد على مقدار السمية منضمة إلى غشاء البلازما. الأهم من ذلك، LLO القابلة للذوبان (ليست ملزمة بغشاء البلازما) بسرعة وبلا رجعة المجاميع عند درجة حرارة تصل إلى 37 ˚C، مما يخفف من الحاجة إلى يغسل الجزيئات السمية غير منضم ويحد من مدى الضرر الغشاء على مر الزمن. وأخيراً، لأن LLO تربط بين الكوليسترول وأشكال المسام في الأغشية الغنية بالكولسترول، هذا التحليل قابلة لمجموعة واسعة من خلايا الثدييات. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن LLO يؤثر على الخلية المضيفة إشارات أساسا عن طريق تشكيل المسام، مع استثناءات قليلة في خلية مستقلة عن المسامية التي قد تحدث مما يشير إلى^{33،34،35،36 ،37،،}من³⁸³⁹. ولذلك، فإنه لا يمكن استبعاد أن LLO مما يشير إلى أنشطة قد تؤثر على عملية إصلاح غشاء.

ويقيم هذا التحليل مباشرة مدى إصابة الخلية بقياس إدماج خلية إيمبيرمينت fluorochrome (مثلاً، يوديد propidium) الذي يدخل الخلايا الجرحى سلبية ويصبح الفلورية العالية بمجرد أنه يربط مع الأحماض النووية . ومن ثم، يمكن الحفاظ على فلوروتشرومي في مستنبت الخلية طوال هذه التجربة، السماح للتحليلات في الوقت الحقيقي للخلية مما أسفر عن إصابة. كثافة fluorescence صبغ الحمض النووي الملزمة سوف تزيد مع تركيز السمية، لتركيز معين من السمية، سوف تزيد مع مرور الوقت حتى تتشكل جميع المسام، وهي إصلاح الخلايا تماما أو حتى يتم التوصل إلى التشبع. تدفق خارج الخلية Ca^{2 +} من خلال مسام الغشاء حدث شرط أساسي لإعادة ختم. ولذلك، يمكن أن يدل كفاءة ريسيلينج غير مباشر بمقارنة إصابة خلية في المتوسط الثقافة التي تحتوي على Ca^{2 +} (حالة الإصلاح الدلالية) لإصابة في Ca^{2 +}-المتوسطة الحرة (إصلاح الشرط التقييدي). نظراً لكثافة fluorescence صبغ الحمض النووي ملزم طرديا مع تركيز خلية في كل بئر، من المهم أن خلايا البذور في تركيز نفسها في جميع الآبار. من المهم أيضا أن تعداد الخلايا في كل بئر قبل وبعد الفحص لضمان أن الخلية المفرزة لم تحدث، كعائم، الخلايا المجمعة يمكن أن تحجب fluorescence القراءات التي قد تؤدي إلى تعقيد تفسير البيانات. تعداد الخلايا، والخلايا معربا عن هيستون النووية مترجمة 2B-التجارة والنقل (H2B-التجارة والنقل) استخدمت في هذا التحليل. التحكم في درجة الحرارة، وضع متعددة، والقراء الميكروسكوبية الجمع بين القياسات السريعة، الفائق (باستخدام تنسيق لوحة 96 أو 384-جيدا) من شدة الأسفار مع التصوير المجهري للخلايا الحية في 37 درجة مئوية. يمكن استخدام هذا الأخير لعد عدد الخلايا ومراقبة تشكيل خلية متميزة السكان في نهاية المطاف.

في نهاية المطاف، هذا الفحص يوفر للمستخدمين القدرة على توسيع معرفتهم بتعقيد آليات إصلاح الغشاء بالكشف عن الجزيئات المضيف أو إصلاح المركبات مناشئ المضافة التي يمكن التحكم في الغشاء. البروتوكول التالية توضح الخطوات التجريبية لقياس كفاءة الخلايا المعرضة ل LLO ريسيلينج وتقييم آثار المخدرات معين أو العلاج الخلوي في كفاءة إعادة ختم.

Protocol

1-إعداد طلاء الخليةملاحظة: الإنسان الخلايا الظهارية عنق الرحم، هيلا وهيلا معربا عن هيستون 2B-التجارة والنقل (H2B-التجارة والنقل)، واستخدمت في هذا البروتوكول، ولكن هذا الفحص يمكن تكييفها ل خلايا الثدييات الأخرى19. فصل الخلايا ملتصقة من 75 سم2 خلية ثقافة قارورة غسل…

Representative Results

خلية عد الدقة: خلايا هيلا كثيرا ما تستخدم كخط خلية الثديية نموذجي لاستكشاف آليات إصلاح الغشاء. عند تقييم إصلاح الغشاء على مستوى السكان الخلية، من المهم أن خلايا لوحة في تركيز نفسها في جميع الآبار لتفسير البيانات المناسبة. من المهم أيضا التحقق من وقت الفحص أن أرقام الخلية …

Discussion

هذا التحليل تدابير كفاءة الغشاء إعادة ختم على مستوى السكان الخلية مع القدرات الإنتاجية العالية. ويمكن استخدامه للكشف عن المكونات الخلوية أو مكتبات المخدرات التي يمكن أن تؤثر على تصليح غشاء. استخدمت مقايسة وصف شكل لوحة 96-جيدا، ولكن فإنه يمكن تكييفها مع لوحات 384-جيدا لأعلى من الناتج. ميزة له…

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG