Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

Summary

Nous décrivons ici un test haut débit fluorescence qui mesure la membrane plasmique rescellage d’efficacité grâce à des analyses fluorimétrique et imageries de cellules vivantes. Ce test peut être utilisé pour le dépistage des drogues ou des gènes de cible qui régulent la membrane plasmique réapposition de sceau sur des cellules mammaliennes.

Abstract

Dans leur environnement physiologique, les cellules de mammifères souvent soumises à des contraintes mécaniques et biochimiques qui donnent lieu à des dommages de la membrane plasmique. En réponse à ces dommages-intérêts, les mécanismes moléculaires complexes refermer rapidement la membrane plasmique pour rétablir sa fonction de barrière et de maintenir la survie des cellules. Malgré les 60 ans de recherche dans ce domaine, il nous manque encore une compréhension approfondie de la cellule réapposition de sceau sur machines. Dans le but d’identifier les composants cellulaires que contrôle rescellement de membrane plasmique ou des médicaments qui peuvent améliorer la réapposition de sceau, nous avons développé un test haut débit basés sur la fluorescence qui mesure la membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères cultivé en microplaques. Comme système modèle pour les dommages de la membrane plasmique, les cellules sont exposées à la listériolysine toxine bactérienne formant des pores O (LLO), qui forme la grande 30-50 nm de diamètre protéique pores en cholestérol contenant les membranes. L’utilisation d’un lecteur de microplaques de multimode thermorégulées permettant la spectrofluorométrie rapide et sensible des mesures en combinaison avec fond clair et imagerie de la microscopie de fluorescence des cellules vivantes. L’analyse cinétique de l’intensité de la fluorescence émise par un fluorochrome de l’acide nucléique-liaison imperméants membrane reflète l’étendue de la membrane blessant et refermer au niveau de la population des cellules, permettant le calcul de la cellule réapposition de sceau sur l’efficacité . Imagerie de la microscopie de fluorescence permet pour le dénombrement des cellules, qui constitutivement expriment une chimère fluorescente de la protéine nucléaire histone 2 b, dans chaque puits de la microplaque pour tenir compte des variations potentielles de leur nombre et permet éventuellement identification des populations cellulaires distincts. Ce test haut débit est un outil puissant devrait s’accroître notre compréhension des mécanismes de réparation de membrane par l’intermédiaire de dépistage des gènes hôtes ou exogène ajouté des rescellement de membrane plasmique ce contrôle.

Introduction

Les cellules de mammifères sont soumis à un stress mécanique, osmotique et biochimique, entraînant la perte d’intégrité de la membrane plasmique. Sans rescellement de rapide et efficace, les cellules endommagées succomberait rapidement à mort programmée ou nécrotique. Depuis les années 1960, les efforts pour comprendre la membrane plasmique rescellage processus ont été motivées par les conséquences dévastatrices, associés à ses dysfonctionnements. En effet, des maladies telles que la branche-Girdle Muscular Dystrophy, le diabète et le Syndrome de Chediak-Higashi ont été liés à déficient membrane plasmique réparation due à des mutations dans le gène codant dysferline, la production de produits de glycation avancée ainsi que les anomalies dans le régulateur de trafic lysosomal CHS1, respectivement^1,2,3,4,5,6. Toutefois, à ce jour, notre compréhension de la membrane rescellage est encore limitée⁷. Les premières études ont démontré que la membrane rescellage est initiée par l’influx d’extracellulaire Ca^{2 +} par le biais de la plasmalemme endommagés^8,9,10. Depuis lors, plusieurs ne s’excluent Ca^{2 +}-mécanismes dépendants ont été proposées pour refermer les cellules. L’hypothèse de patch propose que, à proximité de la plaie, vésicules intracellulaires fusionnent entre eux et la membrane plasmique endommagée d’agir comme un patch^11,12,13,14. Un second modèle propose cette exocytose calcium-dépendante des lysosomes à la plaie site libère la Sphingomyélinase acide enzyme lysosomale, qui convertit la sphingomyéline en céramide dans le feuillet externe de la membrane plasmique. Ce changement soudain dans la composition lipidique entraîne axée sur le céramide endocytose de la région endommagée^15,16,17. Enfin, le troisième mécanisme proposé implique un rôle pour l’endosomale tri complexes nécessaires au transport (ESCRT) promouvoir la formation de vésicules donnant sur l’extérieur qui bourgeonnent hors de la membrane plasmique¹⁸. Uniquement un ensemble limité de protéines a été identifié dans ces modèles, et leurs machines doit être davantage élucidé.

Nous décrivons ici un test haut débit qui la membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères adhérentes soumise à endommager des mesures médiées par recombinaison listériolysine O (LLO)¹⁹. LLO est une toxine en formant des pores (PFT) sécrétée par le pathogène intracellulaire facultatif Listeria monocytogenes^20,21,22 et appartient à la MACPF/CDC (complexe d’attaque membranaire, la perforine, et super-famille cytolysine cholestérol-dépendante). MACPF sont formant des pores mammifères protéines impliquées dans les défenses immunitaires, tandis que les CDC est des toxines bactériennes principalement produites par des agents pathogènes Gram-positifs qui endommagent les cellules de l’hôte pour promouvoir leurs modes de vie pathogènes²³. CDCs sont synthétisées sous forme de monomères solubles dans l’eau ou les dimères qui se lient au cholestérol présent dans la membrane plasmique et oligomerize en un complexe prepore des sous-unités jusqu’à 50. Le complexe prepore réarrange ensuite pour insérer les brins β à travers la bicouche lipidique, formant un pore de β-canon qui s’étend sur 30-50 nm de diamètre^24,25,26,27.  Ces grands pores permettent un flux d’ions et de petites composantes cellulaires dans et hors de la cellule ; Cependant, certaines études ont proposé que les pores de plus petites tailles sont également formé^28,29,30. Entre les CDC, LLO affiche des propriétés uniques, y compris l’agrégation irréversible et température-dépendante du pH, qui est propice à des analyses de haut débit^31,32. LLO peut être ajouté au milieu de culture cellulaire à 4 ° c, une température permissive à sa liaison à des cellules, mais pas à la formation du pore complexe. Ouverture de la formation de pores est synchronisable puis en augmentant la température à 37 ° c, permettant la diffusion efficace des molécules de la toxine dans le plan de la membrane d’oligomères de forme et pour le remodelage conformationnelle impliqués dans la génération de pore. C’est pourquoi, suite à l’interrupteur de température, la cinétique des dommages cellulaires dépendra de la quantité de toxine liée à la membrane plasmique. Ce qui est important, LLO soluble (non lié à la membrane plasmique) rapidement et irréversiblement agrégats lorsque la température atteint 37 ° c, ce qui diminue le besoin d’évacuer les molécules de la toxine non lié et limite l’étendue des dégâts de la membrane au fil du temps. Enfin, parce que LLO se lie au cholestérol et forme des pores dans les membranes riches en cholestérol, ce dosage est favorable à une large gamme de cellules de mammifères. Il est important de garder à l’esprit que LLO affecte la cellule hôte signalisation principalement via la formation de pores, à quelques exceptions près dans quelle cellule indépendante du pore de signalisation peut se produire^{33,34,35,36 ,37,38,},³⁹. Par conséquent, il ne peut pas être exclu que LLO activités peuvent influer sur le processus de réparation de membrane de signalisation.

Ce test évalue directement l’étendue de la cellule blessant en mesurant l’incorporation d’un fluorochrome imperméants cellulaire (p. ex., l’iodure de propidium) qui pénètre les cellules blessées passivement et qui devient très fluorescent une fois qu’il associe à des acides nucléiques . Par conséquent, le fluorochrome peut être maintenu dans le milieu de culture cellulaire pendant toute l’expérience, ce qui permet des analyses en temps réel des cellules blessant. L’intensité de la fluorescence du colorant acide nucléique-liaison augmente avec la concentration de la toxine et, pour une concentration donnée de toxine, augmentera au fil du temps jusqu’à ce que tous les pores sont formés, et les cellules sont entièrement réparés ou jusqu’à ce que la saturation est atteinte. L’afflux d’extracellulaire Ca^{2 +} à travers les pores de la membrane est un événement de la condition sine qua non pour refermer. Par conséquent, l’efficacité de fermeture peut être indirectement attestée en comparant la cellule blessant dans le milieu de culture contenant du Ca^{2 +} (condition permissive de réparation) à blessant d’un Ca^{2 +}-milieu dépourvu (condition restrictive de réparation). Parce que l’intensité de la fluorescence de la teinture de liaison de l’acide nucléique est directement proportionnelle à la concentration cellulaire dans chaque puits, il est important de cellules des graines à la même concentration dans tous les puits. Il est également important d’énumérer des cellules dans chaque puits avant et après le test pour s’assurer que le détachement de cellules ne se produit pas, comme flottant, cellules agrégées peuvent masquer des lectures de fluorescence qui peuvent compliquer l’interprétation des données. Pour énumérer des cellules, les cellules exprimant l’histone nucléaire localisé 2 b-GFP (H2B-GFP) ont été utilisées dans ce test. Température contrôlée, multimode, lecteurs de microplaques allient des mesures rapides et à haut débit (à l’aide d’un format de plaque 96 ou 384 puits) d’intensités de fluorescence avec imagerie microscopie des cellules vivantes à 37 ° C. Ce dernier peut être utilisé pour énumérer le nombre de cellules et observer la formation éventuelle de populations cellulaires distincts.

En fin de compte, ce test offre aux utilisateurs la possibilité d’approfondir leur connaissance de la complexité des mécanismes de réparation de membrane de dépistage pour les molécules de l’hôte ou réparer des composés exogène qui peuvent contrôler la membrane. Le protocole suivant décrit les étapes expérimentales afin de mesurer l’efficacité de fermeture des cellules exposées à la LLO et évaluer les effets d’un médicament ou un traitement cellulaire sur l’efficacité de fermeture.

Protocol

1. préparation Placage de celluleRemarque : Donner naissance à des cellules épithéliales humaines du col utérin, HeLa et HeLa exprimant Histone 2 b-GFP (H2B-GFP), ont été utilisés dans le présent protocole, mais ce test peut être adapté aux autres cellules mammaliennes19. Détacher les cellules adhérentes d’un flacon de culture cellulaire 75 cm2 de laver les cellules avec 2 mL de trypsine-EDTA 0,25 %. Remplacez la trypsine utilisée par 2 mL de 0,25 …

Representative Results

Précision de comptage de cellules : les cellules HeLa sont fréquemment utilisés comme une ligne de cellules de mammifère modèle explorer les mécanismes de réparation de membrane. Lors de l’évaluation de réparation de la membrane au niveau de la population des cellules, il est important de cellules de la plaque à la même concentration dans tous les puits pour l’interprétation des données appropriées. Il est également important de vérifier au moment de l’essai que nom…

Discussion

Ce test mesure l’efficacité de la membrane rescellage au niveau des populations de cellules avec une capacité de haut débit. Il peut être utilisé pour dépister les composants cellulaires ou des bibliothèques de drogues qui pourraient affecter la réparation de la membrane. Le test décrit utilisée un format de plaque à 96 puits, mais il peut être adapté pour les plaques 384 puits pour un débit plus élevé. Un avantage de ce test est sa capacité à obtenir des mesures de fluorescence des cellules vivantes …

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG