Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen
Summary
Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Fluoreszenz basierende Assays, die die Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz durch fluorometrisch und bildgebende Untersuchungen in lebenden Zellen misst. Dieser Test kann verwendet werden, für das screening von Drogen oder Zielgene, die Plasmamembran Wiederverschließen in Säugetierzellen zu regulieren.
Abstract
In ihrer physiologischen Umgebung sind Säugerzellen häufig mechanischen und biochemischen Belastungen ausgesetzt, die Plasmamembran Schäden zur Folge haben. In Reaktion auf diese Schäden verschließen komplexen molekularen Maschinen schnell der Plasmamembran für die Wiederherstellung der Barrierefunktion und Überleben der Zellen zu erhalten. Trotz 60 Jahre Forschung in diesem Bereich fehlen uns noch ein gründliches Verständnis der Zelle Wiederverschließen Maschinen. Mit dem Ziel der Identifizierung von Zellkomponenten haben dieser Kontrolle Plasmamembran Wiederverschließen oder Medikamenten, die Wiederverschließen verbessern können, wir einen Fluoreszenz-basierte Hochdurchsatz-Assay entwickelt, der der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugetierzellen misst kultiviert in Mikrotiterplatten. Als Modellsystem für die Plasmamembran Schaden, sind bakterielle Pore-forming Toxin Listeriolysin O (LLO), bildet große 30-50 nm Durchmesser proteinhaltige in Cholesterin-haltige Poren Zellen ausgesetzt Membranen. Die Verwendung eines Lesers temperaturgeführte Multimode Mikrotestplatte ermöglicht rasche und sensible Spectrofluorometric Messungen in Kombination mit Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie-Imaging lebender Zellen. Kinetische Analyse durch eine Membran impermeant Nukleinsäure-bindenden Fluorochrom emittiert Fluoreszenz-Intensität reflektiert das Ausmaß der Membran Verwundung und Wiederverschließen auf Bevölkerungsebene Zelle, so dass für die Berechnung der Zelle Wiederverschließen Effizienz . Fluoreszenz-Mikroskopie-Bildgebung ermöglicht die Aufzählung der Zellen, die konstitutiv ausdrücken eine fluoreszierende Chimäre aus der nuklearen Protein Histon 2 b, in jede Vertiefung der Mikrotestplatte, um mögliche Schwankungen in ihrer Anzahl zu berücksichtigen und können für eventuelle Identifizierung von unterschiedlichen Zellpopulationen. Dieser Hochdurchsatz-Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug erwartet, um unser Verständnis der Membran Reparaturmechanismen über Screening für Host Gene erweitern oder exogen hinzugefügt, dass Kontrolle Plasmamembran Wiederverschließen Verbindungen.
Introduction
Säugerzellen unterliegen mechanischen, osmotische und biochemischer Stress, was zum Verlust der Integrität der Plasmamembran. Ohne schnelle und effiziente Wiederverschließen, würde geschädigte Zellen programmierten oder nekrotischen Tod schnell erliegen. Seit den 1960er Jahren haben Bemühungen um die Plasmamembran Wiederverschließen Prozess verstehen von den verheerenden Folgen, verbunden mit seiner Funktionsstörungen motiviert. In der Tat sind Krankheiten wie Muskeldystrophie Limb-Gürtel, Diabetes und Chediak-Higashi-Syndrom mit mangelhaft Plasmamembran Reparatur durch Mutationen im gen Kodierung Dysferlin, Produktion von advanced Glycation Endprodukte und defekte verbunden worden die lysosomalen Menschenhandel Regler CHS1, bzw.1,2,3,4,5,6. Allerdings ist bislang, unser Verständnis der Membran Wiederverschließen nach wie vor begrenzt7. Erste Studien haben gezeigt, dass die Membran Wiederverschließen durch den Zustrom von extrazellulären Ca2 + durch die beschädigte Plasmamembran8,9,10initiiert wird. Seitdem sind mehrere nicht gegenseitig Ca2 +-abhängige Mechanismen sind vorgeschlagen worden, um Zellen zu versiegeln. Die Patch-Hypothese schlägt vor, in der Nähe der Wunde, intrazelluläre Vesikeln miteinander und die beschädigten Plasmamembran verschmelzen zu handeln als ein Patch11,12,13,14. Ein zweites Modell schlägt vor, dass Kalzium-abhängige Exozytose Website Versionen von Lysosomen an der Wunde des lysosomalen Enzyms saure Sphingomyelinase, die Sphingomyelin Ceramid im äußeren Merkblatt der Plasmamembran umwandelt. Diese plötzliche Änderung in der Lipidzusammensetzung führt Ceramid-driven Endozytose von der beschädigten Region15,16,17. Schließlich geht der dritte vorgeschlagene Mechanismus eine Rolle für die Endosomal Sortierung komplexer erforderlich für den Transport (ESCRT) Förderung die Bildung von Vesikeln nach außen gerichtete, die Weg von der Plasmamembran18Knospe. Nur eine begrenzte Anzahl von Proteinen in diesen Modellen identifiziert wurde, und ihre Maschinen muss weiter aufgeklärt.
Hier beschreiben wir einen Hochdurchsatz-Assay, den Maßnahmen der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz bei anhaftenden Säugerzellen unterzogen um zu Schäden durch rekombinante Listeriolysin O (LLO)19vermittelt. LLO ist eine Pore-forming Toxin (PFT) abgesondert von der fakultativen intrazellulären Erreger Listeria Monocytogenes20,21,22 und gehört zu den MACPF/CDC (Membrane Angriff komplex, Perforin, und Cholesterin-abhängige Cytolysin)-Superfamilie. MACPF sind Säugetiere Pore-forming Proteine beteiligt, Immunabwehr, während CDCs bakterielle Toxine hauptsächlich sind produziert durch gram-positive Erreger, die Wirtszellen zur Förderung ihrer pathogenen Lebensstile23beschädigen. CDCs sind als wasserlösliche Monomere synthetisiert oder Dimere, die an Cholesterin binden in der Plasmamembran und oligomerize zu einem prepore Komplex von bis zu 50 Untereinheiten. Komplexe Prepore ordnet dann um β-Stränge über die Lipid-Bilayer bildet eine β-Fass-Pore, die 30-50 nm im Durchmesser24,25,26,27umfasst einzufügen. Diese großen Poren erlauben Fluten von Ionen und kleine Zellkomponenten innerhalb und außerhalb der Zelle; jedoch haben einige Studien vorgeschlagen, Poren kleiner Größen auch gebildete28,29,30 sind. Unter die CDCs zeigt LLO einzigartige Eigenschaften einschließlich irreversible pH-Wert und Temperatur-abhängige Aggregation, die förderlich für Hochdurchsatz-Analysen31,32ist. LLO kann Zellkulturmedium bei 4 ° c, eine Temperatur, die freizügig ihre Bindung an Zellen, aber nicht zur Bildung von komplexen Pore hinzugefügt werden. Einleitung der Porenbildung kann dann synchronisiert werden, durch Erhöhung der Temperatur um 37 ° c, so dass für die effiziente Verbreitung der Toxin-Moleküle in der Ebene der Membran zu Form Oligomere und zum Konformationsänderungen Umbau Pore Generation beteiligt. Daher wird nach dem Wechsel der Temperatur, der kinetische Zellschäden die Menge des Toxins an die Plasmamembran gebunden abhängen. Vor allem lösliche LLO (nicht an der Plasmamembran gebunden) rasch und irreversibel aggregiert, wenn die Temperatur 37 ˚C erreicht die verringert die Notwendigkeit ungebundenes Toxin Moleküle abzuwaschen und das Ausmaß der Membranschäden im Laufe der Zeit. Zu guter Letzt, weil LLO an Cholesterin bindet und Cholesterin-reiche Membranen Poren bildet, ist dieser Assay offen für eine Vielzahl von Säugerzellen. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, die LLO betrifft Wirtszelle Signalisierung hauptsächlich über Porenbildung, mit wenigen Ausnahmen in die Pore-unabhängige Zelle Signalisierung kann auftreten,33,34,35,36 ,37,38,39. Es kann also nicht sein, dass LLO Signalisierung Aktivitäten beeinflussen den Prozess der Membran Reparatur ausgeschlossen.
Dieser Assay bewertet direkt das Ausmaß der Zelle Verwundung durch Messung der Einbau von einer Zelle impermeant Fluorochrom (z.B. Propidium Jodid), die passiv verletzte Zellen und wird stark fluoreszierende, sobald es mit Nukleinsäuren assoziiert . Daher kann die Fluorochrom in Zellkulturmedium während das Experiment, so dass Echtzeitanalysen der Zelle Verwundung gepflegt werden. Der Fluoreszenzintensität des Farbstoffs Nukleinsäure-Bindung erhöht die Konzentration des Toxins und für eine bestimmte Konzentration des Toxins wird im Laufe der Zeit erhöhen, bis alle Poren gebildet werden und Zellen sind vollständig repariert oder Sättigung erreicht ist. Der Zustrom von extrazellulären Ca2 + Poren der Membran ist eine conditio Sine Qua Non -Event für Wiederverschließen. Daher die resealing Effizienz kann indirekt nachgewiesen durch den Vergleich Zelle Verwundung in Kulturmedium mit Ca2 + (permissive Reparaturbedingung), Verwundung in einem Ca2 +-freie Mitte (Reparatur einschränkende Bedingung). Da der Fluoreszenzintensität der Nukleinsäure-Bindung Farbstoff direkt proportional zu der Zellkonzentration in jedes gut ist, ist es wichtig, Samenzellen bei der gleichen Konzentration in alle Wells. Es ist auch wichtig, Zellen in jedem gut vor und nach der Test um sicherzustellen, dass die Zelle Ablösung tritt nicht auf, als schwimmende, aggregierte Zellen Fluoreszenz Lesungen verdecken können die Interpretation der Daten erschweren kann, aufzählen. Um Zellen aufzuzählen, wurden Zellen mit dem Ausdruck ihrer nuklearen lokalisiert Histon 2 b-GLP (H2B-GFP) in diesem Test verwendet. Temperaturgeführte, Multimode, kombinieren Mikrotestplatte Leser schnelle Hochdurchsatz-Messungen (mit einem 96 oder 384-Well-Plattenformat) Fluoreszenz-Intensitäten mit Mikroskopie-Bildgebung von lebenden Zellen bei 37 ° C. Letzteres kann verwendet werden, zum Auflisten der Zellzahl und die eventuelle Bildung von unterschiedlichen Zellpopulationen zu beobachten.
Letztlich dieser Assay bietet dem Anwender die Möglichkeit, ihr Wissen über die Komplexität der Membran Reparaturmechanismen durch Screening für Host-Moleküle zu erweitern oder exogen zusätzliche Verbindungen, die Membran steuern können zu reparieren. Das folgende Protokoll beschreibt die experimentellen Schritte, um die resealing Effizienz der Zellen, LLO messen und bewerten die Auswirkungen einer bestimmten Droge oder zellulären Behandlung auf Wiederverschließen Effizienz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Test misst die Effizienz der Membran Wiederverschließen auf Bevölkerungsebene Zelle mit hoher Durchsatzleistung. Es kann verwendet werden zum Bildschirm für zellulären Komponenten oder Droge-Bibliotheken, die Membran Reparatur beeinträchtigen könnten. Der beschriebenen Test verwendet eine 96-Well-Plattenformat, aber es kann auf 384-Well-Platten für höheren Durchsatz angepasst werden. Ein Vorteil dieser Assay ist seine Fähigkeit zur Fluoreszenz-Messungen von anhaftenden lebenden Zellen in Echtzeit ohne üb…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bestätigen Dr. Jesse Kwiek (The Ohio State University) für freundlicherweise ermöglicht es uns, seine Multi-Mode-Erkennung-Plattform für einige Vorversuchen zu nutzen. Forschung berichtet in diesem Artikel wurde durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases von den National Institutes of Health unter Prämiennummer RO1AI107250, Stephanie Seveau unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | i3x | |
| MiniMax 300 Imaging cytometer | Molecular Devices | 5024062 | |
| TO-PRO-3 | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| HeLa | ATCC | CCL2 | |
| HeLa H2B-GFP | Millipore | SCC117 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| 96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate | Corning | 3603 | |
| Hanks' balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| EGTA | ISC BioExpress | 0732-100G | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-(+)-Glucose, HybriMax | Sigma-Aldrich | G5146-1KG |
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