תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

Summary

כאן נתאר של תפוקה גבוהה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד קרום פלזמה חתימת יעילה באמצעות ניתוחים fluorometric, הדמיה בתאים חיים. Assay הזה יכול לשמש לסינון סמים או היעד גנים המווסתים קרום פלזמה חתימת בתאי יונקים.

Abstract

בסביבתם פיזיולוגיים, תאי יונקים נחשפים לעיתים קרובות מושם מכני וביוכימי שתוצאתה נזק קרום פלזמה. בתגובה נזקים אלה, machineries מולקולרית מורכבים במהירות לאטום מחדש קרום פלזמה שחזור תפקידה מכשול ולשמור על הישרדות cell. למרות 60 שנים של מחקר בתחום זה, אנו עדיין חוסר הבנה מעמיקה של התא חתימת מכונות. עם המטרה של זיהוי מרכיבי התא הזה חתימה מחדש של קרום פלזמה של שליטה או תרופות שיכולות לשפר חתימה, פיתחנו assay תפוקה גבוהה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית המודד חתימת יעילות בתאים בתרבית של קרום פלזמה תרבותי ב- microplates. כמערכת מודל עבור נזק קרום פלזמה, תאים נחשפים את חיידקי להיוות נקבובית רעלן listeriolysin O (מתוק), המהווה גדול 30-50 ננומטר קוטר proteinaceous נקבוביות ב כולסטרול המכילים הקרומים. השימוש של קורא מבוקרי טמפרטורה microplate רב במצב מאפשר מדידות spectrofluorometric מהיר ורגיש בשילוב עם brightfield קרינה פלואורסצנטית הדמיה מיקרוסקופיה של תאים חיים. ניתוח קינטי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הנפלטת fluorochrome מחייב חומצת גרעין impermeant הממברנה ומשקף את מידת ממברנה ופצעו וחתימה ברמת האוכלוסייה התא, המאפשר החישוב של התא חתימת יעילות . קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הדמיה מאפשר ספירת תאים, אשר צורונים אקספרס שימרה פלורסנט של חלבון גרעיני היסטון 2B, בתוך כל טוב של microplate להביא בחשבון וריאציות אפשריות במספר שלהם ומאפשרת בסופו של דבר זיהוי של אוכלוסיות תאים נפרדים. זה וזמינותו תפוקה גבוהה הוא כלי רב עוצמה צפויים להרחיב את ההבנה שלנו של מנגנוני תיקון קרום באמצעות הקרנה עבור גנים המארח או exogenously הוסיף תרכובות את חתימת קרום פלזמה שליטה.

Introduction

בתרבית של תאים כפופים לחץ מכני, osmotic ו ביוכימי, והתוצאה היא האובדן של קרום פלזמה שלמות. ללא חתימה מחדש מהיר ויעיל, תאים פגומים שתכניע במהירות למוות מתוכנת או נמק. מאז שנות השישים, מאמצים כדי להבין את קרום פלזמה חתימת תהליך יש כבר מונעים על-ידי ההשלכות ההרסניות הקשורים בתפקוד שלו. אכן, מחלות כגון חגורת הגפיים-ניוון שרירים, סוכרת או תסמונת Chediak-היגאשי קושרו תיקון קרום פלזמה לקויה עקב מוטציות dysferlin קידוד גנטי, הייצור של מוצרי קצה glycation מתקדם, פגמים lysosomal סחר המתקן CHS1, בהתאמה^1,2,3,4,5,6. אולם, נכון להיום, ההבנה שלנו של קרום חתימה הוא עדיין מוגבל⁷. מחקרים ראשוניים הראו כי קרום חתימה הוא שיזם זרם של חוץ-תאית Ca^{2 +} דרך קרום פלזמה פגום^8,9,10. מאז, מספר שאינו-שבחירה Ca^{2 +}-מנגנונים תלויים הוצעו כדי לחתום מחדש תאים. ההשערה תיקון מציעה כי בסמיכות הפצע, שלפוחית תאיים נתיך עם כל קרום פלזמה פגום לפעול כמו תיקון^11,12,13,14. מודל נוסף מציעה אקסוציטוזה סידן תלוית הזה של lysosomes לפצע האתר משחרר את האנזים lysosomal חומצה sphingomyelinase, אשר ממירה ספינגומיילין ceramide בעלון החיצוני של קרום פלזמה. השינוי הפתאומי הזה בהרכב השומנים תוצאות מונחה-ceramide אנדוציטוזה מתוך^16,15,17באזור הפגוע. לבסוף, המנגנון המוצע השלישית כרוכה תפקיד עבור endosomal המיון מורכבים הנדרשים להעברה (ESCRT) לקדם את היווצרות שלפוחית הפונים כלפי חוץ זה באד של קרום פלזמה¹⁸. רק קבוצה מוגבלת של חלבונים זוהה במודלים אלה, מכונות שלהם חייב להיות הובהר עוד יותר.

כאן נתאר וזמינותו של תפוקה גבוהה זה אמצעי קרום פלזמה חתימת יעילות תאים בתרבית של חסיד חשופים לפגיעה מתווכת על-ידי רקומביננטי listeriolysin O (מתוק)¹⁹. מתוק להיוות נקבובית רעלן (PFT) מופרש על ידי המחלה תאיים עיצוב גבות ליסטריה monocytogenes^20,21,22 , שייך לקבוצת ה-MACPF/CDC (ממברנה התקפה מורכבת, perforin, ו superfamily cytolysin תלויי-כולסטרול). MACPF הם יוצרים נקבובית יונקים החלבונים המעורבים מערכות ההגנה החיסוניות, בעוד CDCs טוקסינים חיידקיים בעיקר המיוצר על ידי פתוגנים גראם חיוביים הגורמות נזק לתאים המארח כדי לקדם אורח חיים החולני שלהם²³. CDCs הם מסונתז כמו מונומרים מסיסים במים או הדימרים זה לאגד כולסטרול נוכח קרום פלזמה oligomerize לתוך מתחם prepore subunits עד 50. Prepore מורכב מסדר מחדש ואז להוסיף β-גדילי מעבר ליפידית, ויוצרים נקבובית β-חבית המתפרס על 30-50 ננומטר בקוטר^24,25,26,27.  נקבוביות גדולות אלה מאפשרות פלקסים של יונים ורכיבים הסלולר קטן בתוך ומחוץ לתא. למרות זאת, מספר מחקרים הציעו כי נקבוביות בגדלים קטנים יותר הם גם יצרו^28,29,30. בין CDCs, מתוק מציג מאפיינים ייחודיים, כולל צבירת בלתי הפיך pH טמפרטורה ותלוי, מה שתורם לביצוע ניתוחים תפוקה גבוהה^31,32. ניתן להוסיף מתוק המדיום התרבות התא-4 הלעפה תרוטרפמט, טמפרטורה מתירני כדי שלה מחייב תאים, אך לא את היווצרות הנקבובית מורכבים. חניכה של היווצרות נקבובית ואז ניתן לסנכרן באמצעות העלאת הטמפרטורה הלעפה תרוטרפמט 37, ומאפשר פעפוע יעיל של הרעלן מולקולות במישור של הקרום על טופס oligomers וכן את הבנייה מחדש הסתגלותי מעורב נקבובית הדור. לכן, שלאחר הבורר בטמפרטורה, קינטי של נזק לתאים יהיה תלוי הכמות של רעלן קשור קרום פלזמה. חשוב לציין, מתוק מסיסים (מאוגדים קרום פלזמה) במהירות ובאופן בלתי הפיך אגרגטים כאשר הטמפרטורה מגיעה הלעפה תרוטרפמט 37, אשר מקלה על הצורך לשטוף את הרעלן לא מאוגד מולקולות ומגביל את היקף נזק הממברנה לאורך זמן. לבסוף, מכיוון מתוק נקשר כולסטרול, טפסים נקבוביות ממברנות כולסטרול-עשיר, זה וזמינותו היא לבצע מגוון רחב של תאי יונקים. חשוב לזכור כי מתוק משפיע על התא המארח איתות בעיקר דרך היווצרות נקבובית, עם כמה יוצאים מן הכלל בתא נקבובית שאינו תלוי איזה איתות עלולה להתרחש^{33,34,35,36 ,}–^37,–^38,–³⁹. לכן, זה לא יכול להיות מהכלל הזה מתוק איתות פעילויות עשויה להשפיע על התהליך של תיקון קרום.

זה וזמינותו ישירות מעריך את היקף התא ופצעו על ידי מדידת שיתוף התא impermeant fluorochrome (למשל, יודיד propidium) פסיבי מזין תאים פצועים, הופך מאוד פלורסנט ברגע זה משייך חומצות גרעין . לפיכך, fluorochrome יכול להישמר במדיום התרבות התא לאורך כל הניסוי, ומאפשר ניתוחים בזמן אמת של התא ופצעו. עוצמת קרינה פלואורסצנטית לצבוע חומצת גרעין מחייב יגדל עם ריכוז הרעלן ו, על ריכוז נתון של הרעלן, תגדל עם הזמן עד כל הנקבוביות נוצרות, התאים הם תוקנו או עד רוויה. זרם של חוץ-תאית Ca^{2 +} דרך ממברנה הנקבוביות הוא אירוע קווה נון עבור חתימה מחדש. לכן, יעילות resealing יכול להיות בעקיפין שמעידים השוואת תא ופצעו במדיום תרבות המכיל Ca^{2 +} (תיקון תנאי מתירניות) כדי ופצעו ב Ca^{2 +}-חינם בינוני (תיקון תנאי מגביל). כיוון עוצמת קרינה פלואורסצנטית לצבוע מחייב חומצת גרעין הוא ביחס ישר לריכוז תא היטב לכל, חשוב לתאי הזרע-ריכוז זהה בבארות כל. חשוב גם לספור תאים כל היטב לפני ואחרי וזמינותו כדי להבטיח כי ניתוק התא אינו מתרחש, צפים, מצטברים תאים ניתן להסתיר את קריאות קרינה פלואורסצנטית אשר עלול לסבך את פרשנות הנתונים. לספור תאים, התאים לבטא היסטון גרעיני מותאם לשפות אחרות 2B-GFP (ויזת עבודה H2B-GFP) שימשו זה וזמינותו. מבוקרי טמפרטורה, מצב מרובה, microplate הקוראים לשלב מהירה, תפוקה גבוהה מדידות (באמצעות תבנית 96 או 384-ובכן לוח) של עוצמות קרינה פלואורסצנטית עם מיקרוסקופ הדמיה של תאים חיים ב 37 º C. האחרון יכול לשמש כדי למנות את מספר הטלפון הנייד ולצפות היווצרות בסופו של דבר של אוכלוסיות תאים נפרדים.

בסופו של דבר, וזמינותו זה מספק למשתמשים את היכולת להרחיב את הידע שלהם על המורכבות של מנגנוני תיקון קרום על ידי הקרנה של מולקולות מארח או תרכובות exogenously הוסיף כי עשויות לשלוט ממברנה לתקן. הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים ניסיוני כדי למדוד את היעילות resealing של התאים חשופים מתוק ולהעריך את ההשפעות של התרופה נתון או טיפול הסלולר על יעילות חתימה מחדש.

Protocol

1. הכנה תא יופיצהערה: האדם תאי אפיתל צוואר הרחם, הלה והלה לבטא היסטון 2B-GFP (ויזת עבודה H2B-GFP), שהיו בשימוש פרוטוקול זה, אך assay זו ניתן להתאים בתרבית של תאים אחרים19. ניתוק תאים חסיד מבקבוק 75 ס מ2 תא תרבות ע י שטיפת התאים עם 2 מ של טריפסין-EDTA 0.25%. החלף את טריפסין בשימוש 2 מ…

Representative Results

תא סופר דיוק: הלה תאים משמשים לעתים קרובות כקו בתרבית של תאים דגם לחקור מנגנוני תיקון קרום. בעת הערכת תיקון קרום ברמת האוכלוסייה תא, חשוב לתאי צלחת-ריכוז זהה בבארות כל לפרשנויות הנתונים המתאימים. זה חשוב גם לוודא ביצוע וזמינותו מספרי הטלפון הנייד שלהם שוות ערך מעבר בארות. …

Discussion

Assay זו מודדת את היעילות של קרום חתימת ברמת האוכלוסייה תא עם קיבולת תפוקה גבוהה. זה יכול לשמש עבור מרכיבי התא או ספריות סמים העלולה להשפיע על קרום תיקון מסך. וזמינותו שתואר פעם תבנית צלחת 96-ובכן, אבל זה ניתן להתאים 384-ובכן לוחות עבור תפוקה גבוהה יותר. היתרון הזה וזמינותו הוא היכולת שלו לקבל מד?…

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG