Misurazione di High-throughput di membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero
Summary
Qui descriviamo un’analisi fluorescenza-basata di alto-rendimento che misura la membrana plasmatica risigillazione efficienza attraverso analisi fluorometriche e imaging in cellule viventi. Questo test può essere utilizzato per lo screening di farmaci o geni che regolano la chiusura della membrana plasmatica in cellule di mammifero.
Abstract
Nel loro ambiente fisiologico, cellule di mammiferi sono spesso sottoposti a sollecitazioni meccaniche e biochimiche che si traducono in danno della membrana del plasma. In risposta a questi danni, complessi macchinari molecolari risigillare rapidamente la membrana plasmatica per ripristinare la sua funzione di barriera e mantenere la sopravvivenza delle cellule. Nonostante i 60 anni di ricerca in questo campo, ci manca ancora una conoscenza approfondita della cella una chiusura di macchinari. Con l’obiettivo di identificare componenti cellulari che controllo chiusura della membrana plasmatica o farmaci che possono migliorare la risigillazione, abbiamo sviluppato un’analisi di alto-rendimento fluorescenza-basata che misura la membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero coltivate in piastre microtiter. Come sistema modello per danno della membrana del plasma, le cellule sono esposte per la Listeriolisina di tossina batterica pore-forming O (LLO), che forma il grande 30-50 nm di diametro proteinico pori in colesterolo-contenere le membrane. L’uso di un lettore di micropiastre a modalità multipla temperatura controllata permette misurazioni rapide e sensibili spectrofluorometric in combinazione con campo chiaro e formazione immagine di microscopia di fluorescenza delle cellule viventi. Analisi cinetica dell’intensità di fluorescenza emessa da un fluorocromo acido nucleico-associazione impermeant membrana riflette l’estensione della membrana ferendo e una chiusura a livello di popolazione cellulare, consentendo per il calcolo della cella efficienza una chiusura della . Formazione immagine di microscopia di fluorescenza consente l’enumerazione delle cellule, che costitutivamente esprimono una chimera fluorescente del nucleare della proteina istone 2B, in ciascun pozzetto della micropiastra per tener conto delle variazioni di potenziale nel loro numero e permette per eventuali identificazione di popolazioni distinte delle cellule. Questa analisi di alto-rendimento è un potente strumento prevede di espandere la nostra comprensione dei meccanismi di riparazione della membrana tramite screening per geni ospitanti o esogenicamente aggiunto composti che controllo una chiusura della membrana plasmatica.
Introduction
Cellule di mammifero sono soggetti a sollecitazioni meccaniche, osmotico e biochimici, causando la perdita di integrità della membrana del plasma. Senza una chiusura rapida ed efficiente, le cellule danneggiate sarebbero rapidamente soccombere alla morte programmata o necrotica. Dal 1960, sforzi per comprendere la membrana di plasma una chiusura processo sono stati motivati dalle conseguenze devastanti connesse con sue disfunzioni. Infatti, malattie come la distrofia muscolare dei cingoli, il diabete e la sindrome di Chediak-Higashi sono state collegate alla riparazione della membrana di plasma carente a causa di mutazioni nel gene codifica disferlina, produzione di prodotti finiti avanzati di glycation e difetti di il regolatore di traffico lisosomiale CHS1, rispettivamente1,2,3,4,5,6. Tuttavia, ad oggi, la nostra comprensione della membrana una chiusura è ancora limitata7. Gli studi iniziali hanno dimostrato che la chiusura della membrana viene avviata dall’afflusso di extracellulare Ca2 + attraverso la membrana plasmatica danneggiata8,9,10. Da allora, parecchi non escludono Ca2 +-dipendente meccanismi sono stati proposti per sigillare le cellule. L’ipotesi di patch propone che in vicinanza alla ferita, vescicole intracellulari fusibile con l’altro e la membrana plasmatica danneggiata di agire come un patch11,12,13,14. Un secondo modello propone che l’esocitosi calcio-dipendente dei lisosomi la ferita sito rilascia la sfingomielinasi acida lysosomal degli enzimi, che converte la sfingomielina alla ceramide l’opuscolo esterno della membrana plasmatica. Questo improvviso cambiamento nella composizione lipidica si traduce in ceramide-driven endocitosi del regione danneggiata15,16,17. Infine, il terzo meccanismo proposto prevede un ruolo per il endosomal ordinamento complessi necessari per il trasporto (ESCRT) promuovere la formazione di vescicole di rivolte che bud fuori dalla membrana plasmatica18. Solo un set limitato di proteine è stato identificato in questi modelli, e loro macchinari devono essere ulteriormente chiarito.
Qui descriviamo un saggio di alto-rendimento che misure sulla membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero aderente sottoposto a danni mediati da ricombinante Listeriolisina O (LLO)19. LLO è una tossina che formano dei pori (PFT) secernuta dall’agente patogeno intracellulare facoltativo Listeria monocytogenes20,21,22 ed appartiene al MACPF/CDC (complesso di attacco della membrana, perforina, e Superfamiglia Citolisina colesterolo-dipendente). MACPF sono mammiferi poro-formare proteine coinvolte nelle difese immunitarie, mentre CDCs sono tossine batteriche principalmente prodotte da patogeni Gram-positivi che danneggiano le cellule dell’ospite per promuovere i loro stili di vita patogeni23. CDCs sono sintetizzati come monomeri solubili in acqua o dimeri che si legano al colesterolo presentano nella membrana plasmatica e oligomerizzazione in un complesso prepore di fino a 50 unità secondarie. Il complesso prepore quindi riorganizza per inserire β-fili attraverso il doppio strato lipidico, formando un poro del β-barilotto che si estende su 30-50 nm in diametro24,25,26,27. Questi grandi pori consentono flussi di ioni e piccole componenti cellulari dentro e fuori la cellula; però, alcuni studi hanno proposto che i pori di dimensioni più piccole sono anche formato28,29,30. Tra il CDCs, LLO Visualizza proprietà uniche, tra cui l’aggregazione irreversibile e temperatura-dipendente dal pH, che è favorevole alla analisi di alto-rendimento31,32. LLO possa essere aggiunti al terreno di coltura cellulare a 4 ˚ c, una temperatura permissiva al suo legame alle cellule, ma non per la formazione del poro complessa. L’inizio della formazione dei pori può essere sincronizzato quindi alzando la temperatura a 37 ° c, consentendo la diffusione efficiente delle molecole di tossina nel piano della membrana per formare oligomeri e per il rimodellamento conformazionali coinvolti nella generazione del poro. Pertanto, seguendo l’interruttore della temperatura, la cinetica di danno delle cellule dipenderà la quantità di tossina associata alla membrana plasmatica. D’importanza, LLO solubile (non legato alla membrana plasmatica) rapidamente e irreversibilmente aggrega al raggiungimento della temperatura di 37 ° c, che riduce la necessità di lavare via molecole di tossina non associato e limita l’entità del danno di membrana nel corso del tempo. Infine, perché LLO lega al colesterolo e forma i pori nelle membrane ricchi di colesterolo, questo test è suscettibile di una vasta gamma di cellule di mammifero. È importante tenere a mente che LLO colpisce la cellula ospite segnalazione principalmente attraverso la formazione dei pori, con poche eccezioni in quale cella di poro-indipendente di segnalazione può verificarsi33,34,35,36 ,37,38,39. Pertanto, non può essere escluso che LLO segnalazione attività possono influenzare il processo di riparazione della membrana.
Questo test valuta direttamente la portata della cella ferendo misurando l’incorporazione di un fluorocromo impermeant cella (ad es., ioduro di propidio) che entra nelle cellule ferite e diventa altamente fluorescente, una volta che si associa con acidi nucleici passivamente . Quindi, il fluorocromo possa essere mantenuto in medium della coltura cellulare in tutto l’esperimento, permettendo analisi in tempo reale della cella ferendo. L’intensità di fluorescenza del colorante acido nucleico-associazione aumenterà con la concentrazione della tossina e, per una data concentrazione della tossina, aumenterà nel tempo fino a quando non si formano tutti i pori, e le cellule sono completamente riparate o finché non viene raggiunto la saturazione. L’afflusso di extracellulare Ca2 + attraverso i pori della membrana è un evento di conditio sine qua non per una chiusura. Di conseguenza, l’efficienza risigillazione può essere indirettamente evidenziato confrontando cella ferendo in terreno di coltura contenente Ca2 + (riparazione condizione permissiva) al ferimento in Ca2 +-mezzo libero (condizione restrittiva di riparazione). Poiché l’intensità della fluorescenza del colorante acido nucleico-associazione è direttamente proporzionale alla concentrazione delle cellule in ciascun pozzetto, è importante per le cellule di seme alla stessa concentrazione in tutti i pozzetti. È anche importante enumerare le cellule in ciascun pozzetto, prima e dopo il test per assicurare che distacco cellulare non si verifica, come mobili, cellule aggregate possono oscurare letture di fluorescenza che possono complicare l’interpretazione dei dati. Per enumerare le cellule, le cellule che esprimono nucleare localizzato istone 2B-GFP (H2B-GFP) sono state utilizzate in questo test. Temperatura controllata, multi-mode, lettori di micropiastre combinano misure di rapide, ad alta velocità (utilizzando un formato di piastra 96 o 384 pozzetti) delle intensità di fluorescenza con formazione immagine di microscopia di cellule viventi a 37 ° C. Quest’ultimo può essere utilizzato per enumerare il numero di cell e osservare l’eventuale formazione di popolazioni distinte delle cellule.
In definitiva, questo test fornisce agli utenti la possibilità di ampliare la loro conoscenza della complessità dei meccanismi di riparazione della membrana di screening per molecole ospitanti o ripristino esogenicamente aggiunto composti che possono controllare la membrana. Il seguente protocollo descrive la procedura sperimentale per misurare l’efficienza risigillazione delle cellule esposte a LLO e valutare gli effetti di un dato farmaco o trattamento cellulare sull’efficienza risigillazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo test misura l’efficienza della membrana una chiusura a livello della popolazione di cellule con capacità di alto-rendimento. Può essere utilizzato per schermare per componenti cellulari o librerie di farmaco che potrebbero influire sulla riparazione della membrana. Il saggio descritto utilizzato un formato di piastra a 96 pozzetti, ma può essere adattato a piastre da 384 pozzetti per un throughput più elevato. Un vantaggio di questo test è la sua capacità di ottenere misure di fluorescenza delle cellule vive…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il dottor Jesse Kwiek (The Ohio State University) per averci gentilmente di utilizzare la sua piattaforma di rilevamento multi-modalità per alcuni esperimenti preliminari. Ricerca riportata in questo articolo è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive dei National Institutes of Health, in numero di premio RO1AI107250 da Stephanie Seveau. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | i3x | |
| MiniMax 300 Imaging cytometer | Molecular Devices | 5024062 | |
| TO-PRO-3 | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| HeLa | ATCC | CCL2 | |
| HeLa H2B-GFP | Millipore | SCC117 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| 96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate | Corning | 3603 | |
| Hanks' balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| EGTA | ISC BioExpress | 0732-100G | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-(+)-Glucose, HybriMax | Sigma-Aldrich | G5146-1KG |
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