포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

Summary

여기는 살아있는 세포에서 fluorometric 및 이미징 분석 통해 효율 resealing 플라즈마 멤브레인을 측정 하는 높은 처리량 형광 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 약 또는 포유류 세포에서 원형질 막 resealing 규제 대상 유전자 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

Abstract

그들의 생리 적인 환경에서 포유류 세포 원형질 막 손상 기계 및 생 화 확 적인 스트레스를 자주 받게 됩니다. 이러한 손해에 대응, 복잡 한 분자 기계는 빠르게 원형질 막의 장벽 기능 복원 및 세포 생존을 유지 다시 봉인. 이 분야에 있는 연구의 60 년에 불구 하 고 우리는 여전히 기계를 resealing 셀에 대 한 철저 한 이해 부족. 세포질 구성 요소를 식별 하는 목적으로 그 제어 플라즈마 멤브레인 resealing 또는 resealing, 향상 시킬 수 있는 약물 개발 했습니다 플라즈마 멤브레인 resealing 포유류 세포에 있는 효율성을 측정 하는 형광 기반의 높은 처리량 분석 결과 microplates에서 경작. 원형질 막 손상에 대 한 모델 시스템으로 서 세포 세균 기 공 형성 독 소 listeriolysin O (LLO), 큰 30 ~ 50 nm 직경 배치할 포함 하는 콜레스테롤에 숨 구멍을 형성 하에 노출 되는 세포 막. 명시 및 살아있는 세포의 형광 현미경 이미지와 함께 신속 하 고 민감한 spectrofluorometric 측정 온도 제어 멀티 모드 microplate 리더를 사용 하 여 수 있습니다. 부상 및 효율 resealing 셀의 계산을 허용 세포 인구 수준 resealing 막의 정도 반영 하는 막 impermeant 핵 산 바인딩 형광 색소에 의해 방출 되는 형광 강도의 운동 분석 . 형광 현미경 영상 constitutively 핵 단백질 히스톤 2B 잠재적인 변화 그들의 수에 대 한 계정에 미 판의 각 우물에서의 형광 키메라를 표현 하 고 결국 세포의 열거 허용 뚜렷한 세포 인구의 식별입니다. 이 높은 처리량 분석 결과 호스트 유전자에 대 한 심사를 통해 막 복구 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 확장 하는 것으로 예상 된다 또는 것 추가 하는 강력한 도구는 제어 플라즈마 멤브레인 resealing 화합물 이다.

Introduction

포유류 세포 원형질 막 무결성의 손실의 결과로 기계, 삼 투, 및 생 화 확 적인 스트레스를 받습니다. 신속 하 고 효율적인 resealing 없이 손상 된 세포는 신속 하 게 프로그램 또는 회 저 성 죽음에 굴복 하 고. 1960 년대 이후, 노력 과정 resealing 플라즈마 멤브레인을 이해 하는 엄청난 결과 장애와 관련 된 동기가 있다. 실제로, 사지 띠 근 위축 증, 당뇨병, 및 Chediak-히가시 증후군 같은 질병 돌연변이 유전자 인코딩 dysferlin, 고급 glycation 엔드 제품의 생산에서 및 결함 결핍 플라즈마 막 복구에 연결 되었습니다. lysosomal 밀매 레 귤 레이 터 CHS1, 각각^1,2,,34,,56. 그러나, 날짜, 막의 우리의 이해를 resealing은 여전히 제한^7입니다. 초기 연구는 세포 외 캘리포니아^{2 +} 원형질 막 손상 된^8,,910의 유입에 의해 시작 막 resealing 증명 하고있다. 그 이후, 여러 비 배타적이 캘리포니아^{2 +}-종속 메커니즘 셀 봉인에 제안 되었습니다. 패치 가설 상처에 근접, 세포내 소포는 패치^11,12,,1314로 손상 된 원형질 막 서로와 퓨즈를 제안 합니다. 두 번째 모델 제안 그 칼슘 의존 exocytosis 상처에서 리소좀의 사이트 해제 하는 lysosomal 효소 산 sphingomyelinase, 원형질 막의 외부 전단에서 세 라마 이드 sphingomyelin 변환. 지질 구성에서이 갑자기 변경 결과 손상 된 지역^15,,1617의 세 라마 이드 기반 endocytosis. 마지막으로, 세 번째 제안 된 메커니즘 endosomal 정렬 복잡 한 전송 (ESCRT) 플라즈마 막¹⁸에서 떨어져 새싹 외부와 접한 vesicles의 형성을 촉진 하는 데 필요한에 대 한 역할을 포함 한다. 단백질의 제한 된 집합에 대해서만 이러한 모델에서 확인 된 그리고 그들의 기계를 더 해명 합니다.

여기 우리가 대책 resealing 효율 부착 포유류 세포에서 원형질 막 손상 받게 재조합 listeriolysin O (LLO)¹⁹에 의해 중재 높은 처리량 분석 결과 설명 합니다. LLO facultative 세포내 병원 체 Listeria monocytogenes^20,,2122 분 비는 기 공 형성 독 (PFT) 이며 MACPF/CDC에 속한다 (막 공격 복합물, perforin, 그리고 콜레스테롤-종속 cytolysin) superfamily입니다. MACPF는 포유류 기 공 형성 단백질 반면 CDCs 세균성 독 소 주로 면역 방어에 관련 된 그들의 병원 성 생활²³홍보 호스트 세포 손상 그람 양성 병원 균에 의해 생산. CDCs 수용 성 단위체로 합성 됩니다 또는 콜레스테롤을 바인딩할 이합체 플라즈마 멤브레인에 최대 50 subunits의 복잡 한 prepore에 oligomerize. Prepore 복잡 한 지질 bilayer, β 배럴 공 직경^24,25,,262730-50 nm에 걸쳐 형성에서 β-가닥을 삽입할 다음 재정렬 합니다.  이러한 큰 모 공 세포;와 이온 및 작은 세포 구성 성분의 용 허용 하지만, 일부 연구는 작은 크기의 숨 구멍 형성된^28,,2930도 제안 했다. CDCs, 가운데 LLO 높은 처리량 분석^31,32에 도움이 되는 돌이킬 수 없는 pH 및 온도 의존 집계를 포함 한 독특한 속성을 표시 합니다. LLO 4 ˚C, 셀, 있지만 복잡 한 기 공 형성 수 없습니다 그것의 바인딩을 허용 온도에서 세포 배양에 추가 될 수 있습니다. 기 공 형성의 개시 다음 허용 양식 올리고 하 막의 비행기에 있는 독 소 분자의 효율적인 확산에 대 한 구조적 리 모델링에 대 한 기 공 생성에 관여 하는 37 ˚C를 온도 올려서 동기화 수 있습니다. 따라서, 온도, 세포 손상의 운동에 스위치에 따라 원형질 막에 바인딩된 독 소의 양을에 달라 집니다. 중요 한 것은, 녹는 LLO (원형질 막에 바인딩되지 않은) 신속 하 고 irreversibly 집계 온도 37 ˚C, 언바운드 독 소 분자를 멀리 세척 하는 필요를 완화 하 고 시간이 지남에 막 손상의 범위를 제한에 도달 하면. 마지막으로, LLO 콜레스테롤에 바인딩하고 콜레스테롤이 풍부한 세포 막에 있는 숨 구멍을 형성,이 분석 결과 이므로 다양 한 포유류 세포에 순종. LLO 호스트 셀 기 공 형성을 통해 주로 신호에 영향을 주는 다는 것을 명심 하는 것이 중요 하다는 기 공-독립 셀에 몇 가지 예외 신호^{33,,3435,36 발생할 수 있습니다 ,,3738,39}. 따라서, 그것은 수 없습니다 그 LLO 활동 막 복구의 과정에 영향을 미칠 수 있습니다 신호를 제외.

이 분석 결과 직접 셀 한 셀 impermeant 형광 색소 (예를 들어, propidium 요오드 화물) 수 동적으로 상처 입은 세포를 입력 하 고 높은 형광 일단 핵 산으로 연결 되는의 설립을 측정 하 여 상처의 정도 평가 . 따라서, 허용 셀 부상의 실시간 분석 실험에 걸쳐 세포 배양에는 형광 색소를 유지할 수 있습니다. 핵 산 바인딩 염료의 형광 강도 독 소의 농도 증가 하 고, 독 소의 특정된 농도 대 한 것입니다 시간이 지남에 모든 숨 구멍 형성 되 고 세포는 완전히 수리 될 때까지 또는 증가 채도 도달할 때까지. 세포 외 캘리포니아^{2 +} 막 숨 구멍을 통해 유입 resealing에 대 한 사인 qua 비 이벤트입니다. 따라서, resealing 효율 명시 될 수 있다 직접 하지 셀 부상 포함 된 캘리포니아^{2 +} (수리 허용 조건)는 캘리포니아^{2 +}에서 부상 하는 문화 매체에 비교 하 여-자유로운 매체 (수리 제한적인 조건). 핵 산 바인딩 염료의 형광 강도 각 음에 셀 농도에 직접 비례 하기 때문에 모든 우물에 같은 농도에서 종자 세포에 중요 하다. 그것은 또한 전후에 셀 분리 발생 하지 않습니다, 부동,으로 집계 셀 데이터 해석 복잡 하 게 만들 수 있습니다 하는 형광 읽기 애매 한 수 있도록 분석 결과 셀에 각 잘 열거 하는 것이 중요. 셀, 열거할 지역화 핵 히스톤 2B-GFP (H2B-GFP)를 표현 하는 세포는이 분석 결과에서 사용 되었다. 온도 제어, 멀티 모드 microplate 리더 결합 형광 강렬의 급속 한, 높은 처리량 측정 (를 사용 하 여 96 또는 384-잘 플레이트 형식) 37 ° c.에 살아있는 세포의 현미경 이미징 후자는 휴대폰 번호를 열거 하 고 뚜렷한 세포 인구의 최종 형성 관찰을 사용할 수 있습니다.

궁극적으로,이 분석 결과 사용자 호스트 분자에 대 한 심사에 의해 막 복구 메커니즘의 복잡성의 그들의 지식을 확장 하는 기능을 제공 한다 또는 수리 하는 것 추가 화합물 멤브레인을 제어할 수 있습니다. 다음 프로토콜 LLO에 노출 하는 셀의 resealing 효율성을 측정 하는 실험 단계를 설명 하 고 특정된 약물 또는 resealing 효율성에 세포 치료의 효과 평가.

Protocol

1입니다. 준비 셀 도금참고: 인간 자 궁 경부 상피 세포, 헬러와 히스톤 2B-GFP (H2B-GFP), 표현 헬러가이 프로토콜에서 사용 되었다 그러나이 분석 결과 다른 포유류 세포19에 적용할 수 있습니다. 0.25% Trypsin EDTA의 2 mL와 함께 셀을 세척 하 여 75 cm는2 셀은 문화 플라스 크에서 부착 세포를 분리 합니다. 사용 된 트립 신을 2 mL 신선한 트립 신-EDTA 0.25%의 바꿉니다.<…

Representative Results

셀 계산 정확도: 헬러 세포 막 복구 메커니즘을 탐구 모델 포유류 세포 선으로 자주 사용 됩니다. 세포 인구 수준에서 막 복구를 평가할 때는 적절 한 데이터 해석에 대 한 모든 우물에 같은 농도에서 판 세포에 중요 하다. 그것은 또한 웰 스에서 핸드폰 번호는 해당 시험의 시간에 확인 해야 합니다. 헬러 세포 constitutively 히스톤 2B GFP (H2B-GFP) 융합을 표현 하는이 분석 결과?…

Discussion

이 분석 결과 막 셀 인구 수준 높은 처리량 용량 resealing의 효율성을 측정 합니다. 그것은 사용 될 수 있다 세포 구성 요소 또는 막 복구에 영향을 미칠 수 있는 약물 라이브러리에 대 한 화면으로. 기술된 분석 결과 96 잘 접시 형식을 사용 하지만 높은 처리량에 대 한 384-잘 접시를 적응 시킬 수 있다. 이 분석 결과의 장점은 과도 한 셀 셀 분리, 고정, 또는 형광 라벨 후 고정 등 처리에 대 한 필요 없?…

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG