Høy gjennomstrømming-måling av Plasma membran Resealing effektivitet i pattedyrceller

Summary

Her beskriver vi en høy gjennomstrømming fluorescens-baserte analysen som måler plasma membranen resealing effektivitet gjennom fluorometric og tenkelig analyser i levende celler. Denne analysen kan brukes for screening narkotika eller målet gener som regulerer plasma membranen resealing i pattedyrceller.

Abstract

I fysiologiske miljøet, er pattedyrceller ofte utsatt for mekaniske og biokjemiske påkjenninger som resultere i plasma membranen skader. Svar på disse skadene forsegle komplekse molekylær machineries raskt plasma membranen for å gjenopprette sin barriere funksjon og beholde celle overlevelse. Til tross for 60 år med forskning i dette feltet mangler vi fortsatt en grundig forståelse av cellen resealing maskiner. Med mål om å identifisere cellulære komponenter som kontroll plasma membranen resealing eller stoffer som kan forbedre resealing, har vi utviklet en fluorescens-baserte høy gjennomstrømming analysen som måler plasma membranen resealing effektivitet i pattedyrceller kultivert i microplates. Som et modellsystem for plasma membranen skade, celler blir utsatt for den bakterielle pore-forming gift listeriolysin O (LLO), som danner store 30-50 nm diameter proteinaceous porene i kolesterol inneholder membraner. Bruk av en temperaturkontrollert Multi-mode microplate leser gir raskere og følsom spectrofluorometric mål i kombinasjon med brightfield og fluorescens mikroskopi avbilding av levende celler. Kinetisk analyse fluorescens intensitet slippes ut av en membran impermeant nukleinsyre bindende fluorochrome reflekterer graden av membran såret og resealing på befolkningsnivå celle, slik at beregningen av cellen resealing effektivitet . Fluorescens mikroskopi bildebehandling åpner for opplisting av celler som constitutively uttrykke et fluorescerende chimera av kjernefysiske protein histone 2B, i hver brønn av microplate å ta hensyn til mulige variasjoner i antall og tillater eventuell Identifikasjon av ulike celle populasjoner. Denne høy gjennomstrømming analysen er et kraftig verktøy vil utvide vår forståelse av membran reparasjonsmekanismene via screening for verten gener eller exogenously legges forbindelser som kontroll plasma membranen resealing.

Introduction

Pattedyrceller er underlagt mekanisk osmotisk og biokjemiske stress, noe som resulterer i tap av plasma membranen integritet. Uten rask og effektiv resealing, vil skadede celler raskt bukke til programmert eller nekrose død. Siden 1960, har innsats for å forstå plasma membranen resealing prosessen vært motivert av den ødeleggende konsekvenser forbundet med sin dysfunksjoner. Faktisk har sykdommer som lem-belte muskeldystrofi, diabetes og Chediak-Higashi syndrom vært knyttet til mangelfull plasma membranen reparasjon mutasjoner i genet koding dysferlin, produksjon av avanserte glycation end produkter og feil i lysosomale menneskehandel regulator CHS1, henholdsvis^1,2,3,4,5,6. Men hittil, vår forståelse av membran er resealing fortsatt begrenset⁷. Første studier har vist at membran resealing startes av tilstrømningen av ekstracellulære Ca^{2 +} gjennom skadet plasma membranen^8,9,10. Siden da har flere ikke-gjensidig utelukkende Ca^{2 +}-avhengige mekanismer har vært foreslått å reseal celler. Oppdateringen hypotesen foreslår at i nærhet til såret, intracellulær blemmer sikring med hverandre og skadet plasma membranen som en oppdatering^11,12,13,14. En andre modellen foreslår at kalsium-avhengige exocytosis lysosomer på såret området utgivelser lysosomale enzym syre sphingomyelinase, som konverterer sphingomyelin til ceramide i ytre heftet av plasma membranen. Denne plutselige endringen i lipid komposisjon resulterer i ceramide-drevet endocytose skadet område^15,16,17. Til slutt, den tredje foreslåtte mekanismen innebærer en rolle for endosomal sorteringen komplekse kreves for transport (ESCRT) å fremme dannelsen av utover mot blemmer som bud av plasma membranen¹⁸. Bare et begrenset antall proteiner ble identifisert i disse modellene, og deres maskiner må bli ytterligere belyst.

Her beskriver vi en høy gjennomstrømming analysen som måler plasma membranen resealing effektivitet i tilhenger pattedyrceller utsatt for skade formidlet av rekombinant listeriolysin O (LLO)¹⁹. LLO er en pore-forming gift (PFT) utskilles av facultative intracellulær patogen Listeria monocytogenes^20,21,22 og tilhører MACPF/CDC (membran komplekset, perforin, og kolesterol-avhengige cytolysin) gruppe. MACPF er pattedyr pore-forming proteiner involvert i immunforsvar, mens CDCs er bakteriell giftstoffer hovedsakelig produsert av Gram-positive patogener som skader vertsceller å fremme deres patogene livsstil²³. CDCs er synthesized som vannløselige monomerer eller dimers som binder til kolesterol presentere i plasma membranen og oligomerize til et prepore kompleks av opptil 50 underenheter. Prepore komplekse ordner deretter sette β-tråder over lipid bilayer, danner en β fat pore over 30-50 nm i diameter^24,25,26,27.  Disse store porer tillater flukser ioner og små cellulære komponenter av cellen; men har noen studier foreslått at porene i mindre størrelser er også dannet^28,29,30. Blant CDCs viser LLO unike egenskaper inkludert irreversibel pH – og temperaturen-avhengige aggregering, som bidrar til høy gjennomstrømming analyser^31,32. LLO kan legges til celle kultur medium på 4 grader, en temperatur ettergivende til sin binding til celler, men ikke til dannelsen av pore komplekse. Initiering av pore formasjon kan deretter synkroniseres ved å heve temperaturen å 37 grader, slik at for effektiv spredningen av gift molekyler i flyet av membranen til skjemaet oligomers og conformational remodeling involvert i pore generasjon. Derfor avhenger etter bryteren i temperatur, kinetisk celle skade av mengden giftstoffer bundet til plasma membranen. Viktigere, løselig LLO (ikke bundet til plasma membranen) raskt og irreversibelt samler når temperaturen når 37 grader, noe som reduserer behovet for å vaske bort ubundet gift molekyler og begrenser omfanget av membran skader over tid. Til slutt, fordi LLO binder til kolesterol og danner porene i kolesterol-rik membraner, denne analysen er mottakelig for en rekke pattedyrceller. Det er viktig å huske at LLO påvirker verten celle signalisering hovedsakelig via pore formasjon, med noen få unntak i hvilken pore-uavhengig celle signalisering oppstå^{33,34,35,36 ,37,38,39}. Derfor kan det ikke være utelukket at LLO signalering aktiviteter kan påvirker membranen reparasjon.

Denne analysen vurderer direkte omfanget av cellen såret ved å måle inkorporering av en celle impermeant fluorochrome (f.eks, propidium iodide) som passivt går inn sårede celler og blir svært fluorescerende når det knytter nukleinsyrer . Derfor kan fluorochrome vedlikeholdes i celle kultur medium hele eksperimentet slik at sanntid analyser av cellen såret. Fluorescens intensiteten av nukleinsyre bindende fargestoff vil øke med konsentrasjonen av gift, og for en gitt konsentrasjon av gift, vil øke over tid til alle porene er dannet, og cellene er fullt reparert eller metning er nådd. Tilstrømningen av ekstracellulære Ca^{2 +} gjennom membranen porene er et sine qua non begivenhet for resealing. Derfor resealing effektiviteten kan bevitnes indirekte ved å sammenligne celle såret i kultur medium inneholder Ca^{2 +} (reparasjon ettergivende tilstand) til såret i en Ca^{2 +}-fri medium (reparasjon restriktive tilstand). Fordi fluorescens intensiteten av nukleinsyre bindende fargestoff er direkte proporsjonal med cellen konsentrasjonen i hver brønn, er det viktig å frø celler på samme konsentrasjonen i alle brønnene. Det er også viktig å nummerere celler i hver brønn før og etter analysen slik at celle avdeling ikke oppstår, som flytende, aggregert celler kan skjule fluorescens målinger som kan komplisere data tolkning. Hvis du vil nummerere celler, ble celler som uttrykker kjernefysiske lokalisert histone 2B-GFP (H2B-GFP) brukt i denne analysen. Temperatur-kontrollert, multi-modus, microplate lesere kombinerer rask, høy gjennomstrømming målinger (med en 96 eller 384-vel plate format) av fluorescens intensiteter med mikroskopi avbilding av levende celler på 37 ° C. Sistnevnte kan brukes til å nummerere celle nummer og observere endelige dannelsen av ulike celle populasjoner.

Til slutt denne analysen gir brukere muligheten til å utvide sin kunnskap om kompleksiteten i membranen reparasjonsmekanismene av screening for verten molekyler eller exogenously lagt forbindelser som kan styre membran reparere. Det følgende beskriver eksperimentelle trinnene for å måle resealing effektiviteten av celler som er utsatt for LLO og evaluere effekten av et gitt stoff eller cellular behandling på resealing effektivitet.

Protocol

1. forberedelse Cellen PlatingMerk: Human cervical epitelceller, jakten og HeLa uttrykke Histone 2B-GFP (H2B-GFP), ble brukt i denne protokollen, men denne analysen kan tilpasses til andre pattedyrceller19. Koble tilhenger celler fra en 75 cm2 celle kultur kolbe ved å vaske cellene med 2 mL Trypsin-EDTA 0,25%. Erstatte den brukte trypsin med 2 mL frisk trypsin-EDTA 0,25%. Inkuber cellene på 37 grader i 5 min til cellene har avrundede og løsrevet fra f…

Representative Results

Cellen teller nøyaktighet: HeLa celler brukes ofte som en modell pattedyr cellen linje for å utforske membran reparasjonsmekanismene. Når vurdere membran reparasjon på befolkningsnivå cellen, er det viktig å plate celler på samme konsentrasjonen i alle brønner for riktig data tolkning. Det er også viktig å kontrollere på tidspunktet for analysen at cellen tallene er tilsvarende over brønner. HeLa celler som uttrykker constitutively histone 2B del GFP (H2B-GFP) ble introdusert …

Discussion

Denne analysen måler effektiviteten av membran resealing på befolkningsnivå cellen med høy gjennomstrømming kapasitet. Den kan brukes til skjermen for cellulære komponenter eller narkotika biblioteker som kan påvirke membran reparasjon. Beskrevet analysen brukt en 96-brønns plate format, men det kan tilpasses til 384-vel plater for høyere gjennomstrømming. En fordel med denne analysen er dens evne til å få fluorescens målinger av tilhenger levende celler i sanntid uten overdreven cellen behandling som cellen…

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG