Hög genomströmning mätning av plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller

Summary

Här beskriver vi en hög genomströmning fluorescens-baserad analys som mäter plasmamembranet återförslutning effektivitet genom fluorometric och imaging analyser i levande celler. Denna analys kan användas för screening droger eller målgener som reglerar plasmamembranet återförslutning i däggdjursceller.

Abstract

I deras fysiologiska miljön utsätts däggdjursceller ofta för mekaniska och biokemiska betonar att plasmamembranet skadas. Svar på dessa skador återförslut komplexa molekylära maskinerier snabbt plasmamembranet för att återställa dess barriärfunktion och upprätthålla cellöverlevnad. Trots 60 års forskning på detta område saknar vi fortfarande en grundlig förståelse av cellen återförslutning maskiner. Med målet att identifiera cellulära komponenter att kontroll plasmamembranet återförslutning eller läkemedel som kan förbättra återförslutning, har vi utvecklat en fluorescens-baserade högt dataflöde test som mäter plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller odlade i mikroplattor. Som modellsystem för plasmamembranet skada, celler utsätts för den bakteriella pore-bilda toxin listeriolysin O (LLO), som bildar stora 30-50 nm diameter proteinhaltiga porer i kolesterol-innehållande membran. Användning av en temperatur-kontrollerad multi-mode microplate reader möjliggör snabb och känslig spectrofluorometric mätningar i kombination med brightfield och fluorescence mikroskopi avbildning av levande celler. Kinetic analys av fluorescensintensiteten som avges av en membran impermeant nukleinsyra-bindande fluorokrom avspeglar i vilken utsträckning av membran såra och återförslutning på cell befolkningen nivå, vilket möjliggör beräkning av cellen återförslutning effektivitet . Fluorescence mikroskopi imaging tillåter för uppräkning av celler, som konstitutivt express en fluorescerande chimär av den nukleära protein Histon 2B, i varje brunn mikroplattan att ta hänsyn till eventuella variationer i antalet och möjliggör eventuell identifiering av olika cellpopulationer. Denna hög genomströmning-analysen är ett kraftfullt verktyg förväntas expandera vår förståelse av membran reparationsmekanismer via screening för värd gener eller exogent läggas föreningar att kontroll plasmamembranet återförslutning.

Introduction

Däggdjursceller är föremål för mekanisk, osmotisk och biokemisk stress, vilket resulterar i förlust av plasmamembranet integritet. Utan snabb och effektiv återförslutning, skulle skadade celler snabbt duka under programmerad eller nekrotiska ihjäl. Sedan 1960-talet, har ansträngningar att förstå plasmamembranet återförslutning processen motiverats av de förödande konsekvenser i samband med dess dysfunktioner. Nämligen har sjukdomar såsom lem-gördel muskeldystrofi, diabetes och Chediak-Higashi syndromet varit kopplade till bristfällig plasmamembranet reparation på grund av mutationer i genen kodning dysferlin, produktion av avancerad glykation end produkter och defekter i de lysosomala människohandel regulatorn CHS1, respektive^1,2,3,4,5,6. Hittills har vår förståelse av membran är återförslutning dock fortfarande begränsad⁷. Inledande studier har visat att membranet återförslutning initieras av tillströmningen av extracellulära Ca^{2 +} genom den skadada plasmamembranet^8,9,10. Sedan dess har flera icke-ömsesidigt uteslutande Ca^{2 +}-beroende mekanismer har föreslagits att återförsluta celler. Patch hypotesen föreslår att intracellulära blåsor i närhet till såret, säkring med varandra och skadade plasmamembranet att agera som en patch^11,12,13,14. En andra modell föreslår att kalcium-beroende exocytos av lysosomer på såret webbplats släpper det lysosomala enzymet syra sphingomyelinase, som omvandlar ceramidas till ceramide i den yttre bipacksedeln av plasmamembranet. Denna plötsliga förändring i lipid sammansättningen resulterar i ceramide-driven endocytos av skadade region^15,16,17. Slutligen involverar den tredje föreslagna mekanismen en roll för endosomal sorteringen komplex krävs för transport (ESCRT) att främja bildandet av vetter utåt blåsor som knoppas av från plasmamembranet¹⁸. Endast en begränsad uppsättning proteiner identifierades i dessa modeller, och deras maskiner måste belysas ytterligare.

Här beskriver vi en hög genomströmning analysmetod som åtgärder plasmamembranet återförslutning effektivitet i vidhäftande däggdjursceller utsätts för skada medieras av rekombinant listeriolysin O (LLO)¹⁹. LLO är ett por-bilda toxin (PFT) utsöndras av fakultativt intracellulär patogenen Listeria monocytogenes^20,21,22 och tillhör MACPF/CDC (membran attack complex, perforin, och kolesterol-beroende cytolysin) superfamiljen. MACPF är däggdjur pore-bilda proteiner involverade i immunförsvar, CDCs är bakteriella toxiner främst produceras av grampositiva patogener som skada värdceller att främja deras sjukdomsframkallande livsstil²³. CDCs syntetiseras som vattenlösliga monomerer eller dimerer som binder till kolesterol presentera i plasmamembranet och oligomerize i ett prepore komplex av upp till 50 subenheter. Den komplexa prepore sorterar sedan om du vill infoga β-slingor över de lipid lipidens, bildar en β-fat por som sträcker sig över 30-50 nm i diameter^24,25,26,27.  Dessa stora porer tillåta flöden av joner och små cellulära komponenter och ut ur cellen; vissa studier har dock föreslagit att porerna i mindre storlekar är också bildade^28,29,30. Bland CDCs visar LLO unika egenskaper inklusive irreversibel pH – och temperatur-anhörigen aggregering, som bidrar till hög genomströmning analyser^31,32. LLO kan läggas till i cellodlingsmedium vid 4 ° c, en temperatur som är tillåtande till dess bindning till celler, men inte till bildandet av pore komplexa. Inledande av pore bildandet kan sedan synkroniseras genom att höja temperaturen till 37 ° c, möjliggör för effektiv spridning av toxin molekyler i planet av membranet att bilda oligomerer och för den konfirmerande remodeling inblandade i pore generation. Därför, efter växeln i temperatur, den kinetiska av cellskador beror på mängden av toxin bundet till plasmamembranet. Allt lösligt LLO (inte bundet till plasmamembranet) snabbt och oåterkalleligt aggregerar när temperaturen når 37 ˚C, vilket minskar behovet av att tvätta bort obundna toxin molekyler och begränsar omfattningen av membran skador över tid. Slutligen, eftersom LLO binder till kolesterol och bildar porer i kolesterol-rika membran, denna analys är mottagliga för ett brett utbud av däggdjursceller. Det är viktigt att Tänk på att LLO påverkar värdcell signalering huvudsakligen via pore formation, med några få undantag i vilken pore-oberoende cell signalering kan uppstå^{33,34,35,36 ,37,38,39}. Därför, det kan inte vara uteslutet att LLO signalering verksamhet kan påverka processen för membran reparation.

Denna analys bedömer direkt omfattningen av cell såra genom att mäta införlivandet av en cell impermeant fluorokrom (t.ex., propidium jodid) som passivt kommer in skadade celler och blir starkt fluorescerande när kopplas nukleinsyror . Därför kan fluorokrom bibehållas i cellodlingsmedium hela experimentet, så att realtid analyser av cell såra. Fluorescensintensiteten hos nukleinsyra-bindande färgämnet kommer att öka koncentrationen av toxin och, för en given koncentration av toxin, ökar med tiden tills alla porerna bildas och cellerna fullt repareras eller mättnad uppnåtts. Inflödet av extracellulära Ca^{2 +} genom membran porer är ett oeftergivligt villkor evenemang för återförslutning. Därför resealing effektivitet kan bevisas indirekt genom att jämföra cell såra i odlingsmedium som innehåller Ca^{2 +} (reparation tillåtande tillstånd) att såra i en Ca^{2 +}-gratis medium (reparation restriktiva villkor). Eftersom fluorescensintensiteten hos nukleinsyra-bindande färgämnet är direkt proportionell mot cellkoncentrationen av i varje brunn, är det viktigt att utsäde celler i samma koncentration i alla brunnar. Det är också viktigt att räkna upp celler i varje brunn före och efter analysen till att cellen avlossning ska inte uppstå, som flytande, aggregerade celler kan skymma fluorescens avläsningar som kan komplicera tolkning av data. För att räkna upp celler, användes celler som uttrycker kärn-lokaliserad Histon 2B-GFP (H2B-GFP) i denna analys. Temperatur-kontrollerad, multi-mode, mikroplattan läsare kombinera snabb, hög genomströmning mätningar (med ett 96 eller 384-well platta format) av fluorescens stödnivåer med mikroskopi avbildning av levande celler vid 37 ° C. Den senare kan användas för att räkna upp antalet celler och observera eventuella bildandet av olika cellpopulationer.

Slutligen, denna analys ger användare möjlighet att utöka sina kunskaper om komplexiteten i membran reparationsmekanismer genom screening för värd molekyler eller exogent extra föreningar som kan styra membranet reparera. Följande protokoll beskriver de experimentella steg för att mäta celler utsätts för LLO resealing effektivitet och utvärdera effekterna av ett visst läkemedel eller cellulära behandling på återförslutning effektivitet.

Protocol

1. beredning Cell pläteringObs: Human cervical epitelceller, HeLa och HeLa uttrycker Histon 2B-GFP (H2B-GFP), användes i detta protokoll, men denna analys kan anpassas till andra däggdjursceller19. Lossa fastsittande celler från en 75 cm2 cell kultur mätkolv genom att tvätta cellerna med 2 mL av Trypsin-EDTA 0,25%. Byt ut den använda trypsin med 2 mL färsk trypsin-EDTA 0,25%. Inkubera cellerna vid 37 ˚C för 5 min tills cellerna har rundade och …

Representative Results

Cell räknar noggrannhet: HeLa celler används ofta som en modell cellinje för att utforska membran reparationsmekanismer. Vid bedömningen av membran reparation på populationsnivå cell, är det viktigt att plattan celler i samma koncentration i alla brunnar för tolkning av korrekt data. Det är också viktigt att kontrollera vid tiden för analysen att cell nummer är likvärdiga över brunnar. HeLa celler som konstitutivt express Histon 2B smält till GFP (H2B-GFP) infördes i denna…

Discussion

Denna analys mäter effektiviteten i membran återförslutning på cellnivån befolkning med hög genomströmning kapacitet. Det kan användas till skärmen för cellulära komponenter eller drogen bibliotek som skulle kunna påverka membran reparation. Beskrivna analysen använde ett plattan med 96 brunnar format, men det kan anpassas till 384 brunnar för högre genomströmning. En fördel med denna analys är dess förmåga att erhålla fluorescens mätningar av vidhäftande levande celler i realtid utan att behöva a…

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG