Fastsettelse av reproduktive kompetanse ved bekrefter pubertale utbruddet og utføre en fruktbarhet analysen i mus og rotter
Summary
Mange behandlinger og genetiske mutasjoner påvirke tidspunktet for seksuell modenhet og fruktbarhet. Denne protokollen beskriver en ikke-invasiv metode for å evaluere pubertale utbruddet i mus og rotter før definere en fruktbarhet studie i seksuell modne dyr.
Abstract
Vurdering av reproduktive kompetanse er avgjørende for å forstå virkningen av en behandling eller genetisk manipulasjon på reproduktive aksen, også kalt hypothalamus-hypofyse-gonadal aksen. Den reproduktive aksen er en nøkkel integrator miljømessige og intern inngang tilpasse fruktbarhet til gunstige vilkår for reproduksjon. Før embarking på en fruktbarhet studie i mus og rotter, seksuell modenhet evalueres for å utelukke muligheten for at de observerte reproduktive fenotyper skyldes forsinket eller fraværende pubertale utbruddet. Denne protokollen beskriver en ikke-invasiv tilnærming for å vurdere pubertale utbruddet menn gjennom fastsettelse av preputial separasjon og kvinner gjennom skjedeåpningen og første estrus. Etter ferdigstillelse av puberteten og oppnåelse av seksuell modenhet, kan en fruktbarhet studie startes. Prosedyren beskriver optimal avl betingelsene for mus og rotter, hvordan du setter opp en fruktbarhet studie og hvilke parametre for å evaluere og fastslå om behandling eller genet sletting har innvirkning på fruktbarheten.
Introduction
Overgangen gjennom puberteten er nødvendig for å oppnå seksuell modenhet og reproduktive kompetanse. Pubertale overgangen og vedlikehold av fruktbarhet i voksen alder er regulert av den reproduktive aksen, også kalt hypothalamus-hypofyse-gonadal aksen (figur 1). Tidspunktet for pubertale utbruddet og vedlikehold av fruktbarhet er strengt regulert av interne samt miljømessige faktorer for å øke sjansene for overlevelse av avkom og foreldre1,2. Denne protokollen gir en ikke-invasiv tilnærming for å fastslå pubertale utbruddet i mus og rotter å bekrefte seksuell modenhet før sette opp en fruktbarhet studie for å vurdere reproduktive kompetanse.
En fruktbarhet studie utføres i seksuell modne dyr og kan startes etter dyrene har gått gjennom puberteten. Før pubertale utbruddet, reproduktive aksen er quiescent, og den viktigste driveren av kjønnsmodning, gonadotropin – lanserer hormone (GnRH), er utgitt på hypofysen i utilstrekkelige mengder å starte puberteten (figur 1). Pubertale utbruddet er en komplisert prosess som resulterer i økt GnRH utgivelsen på median eminense. GnRH fremmer luteiniserende hormon (LH) og follicle stimulerende hormone (FSH) sekret fra hypofysen, to hormoner avgjørende for gonadal modning og reproduktive funksjon (figur 1)3,4,5 .
Fornærmelser reproduktive aksen føre til redusert fruktbarhet og kan også advance eller forsinkelse pubertale utbruddet. Kjent for å påvirke tidsberegningen av pubertale utbruddet og reproduktive kompetanse vilkårene eksponering endokrine forstyrre kjemikalier6,7, økt/redusert kroppen vekt1,8, endringer i dag lengde2,9 og genetiske mutasjoner10,11,12,13,14,15.
Utbruddet av seksuell modenhet er et viktig skritt som må fullføres før du setter opp en fruktbarhet analysen. Fordelene med å bestemme pubertale utbruddet gjennom preputial fargeseparasjoner, skjedeåpningen og første estrus, er ikke-invasiv kjennetegner disse prosedyrene, som de ikke krever blod samling eller ofringen av dyr16, 17.
Etter pubertale utbruddet bestemmes, riktig å sette opp en fruktbarhet studie vil gi viktig informasjon om integriteten av reproduktive aksen, og vanligvis har den andre fordelen å generere forsøksdyr for videre studier (raffinement) 18. fruktbarhet studie oppsettet beskrevet i denne protokollen kan oppdage både små og store underskudd i reproduktive kompetanse hos menn og kvinner. Viktige parametere vurdert inkluderer 1) tid til det første kullet, 2) antall kull genereres i en gitt tidsramme og 3) søppel størrelse. Til slutt, anbefalinger for typen oppfølging studier som kan gjennomføres for å identifisere årsaken til ufrivillig verdifall er inkludert.
Beskrevet protokollen refererer til mus og representant data gjenspeiler arbeidet i transgene mus. Alle inkludert protokollene er imidlertid like gyldig i rotter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det totale wellbeing av mus er avgjørende for en vellykket fruktbarhet analysen21. Når du utfører en fruktbarhet analysen, er det viktig å ikke fysisk kontrollere på mus hver dag som dette kan føre til stress. Videre unngå hyppige bur endringer som disse er også stressende. Ideelt vil bur endringer bli gjort mer enn 1 – 2 ganger per uke. Lyseksponering i mørke fasen påvirker negativt avl i nattlige gnagere. Ikke slå på lysene i avl rommet i de mørke timene. Hvis oppføringen til romme…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jeg takker forfatterne bidrar til det første arbeidet som er grunnlaget for denne publikasjonen. Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan og Erica L. Schoeller for hjelpe forbereder manuskriptet. Takk til Jessica Sora Lee og Austin hake for kundestøtte for manuskriptet. H.M.H. ble støttet av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & menneskelig utvikling av National Institutes of Health under prisen nummer R00HD084759.
Materials
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
Riferimenti
- Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. . Reproduction. , (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. . The Laboratory Mouse. , (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Biologia dello sviluppo. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology — Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
