Imaging celle interaktion i trakeal slimhinde under Influenza virusinfektion ved hjælp af to-foton Intravital mikroskopi

Summary

I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol for at udføre to-foton intravital imaging og celle interaktionsanalyser i murine trakeal slimhinde efter infektion med influenza-virus. Denne protokol vil være relevant for forskere studerer immun celle dynamics under luftvejsinfektioner.

Abstract

Analyse af celle-celle eller celle-patogen interaktion i vivo er et vigtigt redskab til at forstå dynamikken i den immun reaktion på infektion. To-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) giver mulighed for observation af celle interaktioner i dybe væv i levende dyr, og minimere photobleaching genereret under image erhvervelse. Til dato har været beskrevet forskellige modeller for 2P-IVM af lymfoide og ikke-lymfoide organer. Billeddannelse af åndedrætsorganerne er imidlertid fortsat en udfordring på grund af den bevægelse i forbindelse med vejrtrækning cyklus af dyret.

Her, beskriver vi en protokol for at visualisere i vivo immun celle interaktioner i luftrøret af mus smittet med influenzavirus ved hjælp af 2 P-IVM. Til dette formål udviklede vi en brugerdefineret imaging platform, som omfattede kirurgiske eksponering og intubation af luftrøret, efterfulgt af erhvervelse af dynamiske billeder af neutrofile og dendritiske celler (DC) i slimhinden epitel. Derudover detaljerede vi de nødvendige skridt for at udføre influenza intranasal infektion og flow cytometric analyse af immunceller i luftrøret. Endelig, vi analyseret neutrofile og DC motilitet samt deres interaktioner i løbet af en film. Denne protokol giver mulighed for generation af stabile og lyse 4D billeder nødvendigt for vurdering af celle-celle interaktioner i luftrøret.

Introduction

To-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) er en effektiv teknik til realtid imaging af celle-til-celle interaktioner som de forekommer i deres naturlige miljø¹. En af de vigtigste fordele ved denne metode er, at det giver studiet af cellulære processer på en større modellen dybde (500 µm til 1 mm) sammenlignet med andre traditionelle billeddiagnostiske teknikker². På samme tid minimerer brugen af to lav-energi fotoner genereret af to-foton laser væv foto-skader typisk tilknyttet image erhvervelse processen². I det sidste tiår, er 2P-IVM blevet anvendt for at studere forskellige typer af celle-celle interaktioner i flere discipliner^3,4,5. Disse undersøgelser har været særligt relevant at undersøge immunceller, som er karakteriseret ved høj dynamik og dannelsen af fremtrædende kontakter efter de signaler, der er genereret af andre celler og miljøet. 2P-IVM er også blevet anvendt til at studere samspillet mellem patogen og vært⁶. Ja, det har tidligere vist sig at nogle patogener kan ændre type og varighed af kontakter mellem immunceller, hæmmer, som et resultat, immunrespons⁷.

Luftvejene slimhinde er det første sted, hvor immunrespons mod luftbårne patogener er genereret⁸. Derfor, i vivo analyse af pathogen-værtssammenspil i dette væv er afgørende at forstå indledning af forsvarsmekanismer vært under infektion. 2P-IVM af luftvejene er imidlertid udfordrende hovedsagelig på grund af artefakter fremstillet af vejrtrækning cyklus af dyr, der bringer processen med billede erhvervelse. For nylig, forskellige kirurgiske modeller er blevet beskrevet for billedbehandling murine luftrøret^9,10,11,12 og lungerne^{13,14,15, 16}. Luftrør 2P-IVM modeller repræsenterer en fremragende set-up til at visualisere den indledende fase af immunreaktion i de øvre luftveje, mens lunge-alveolerne 2P-IVM modeller er mere velegnede til at studere den sene fase af infektioner. De udviklede lunge modeller præsentere en begrænsning forbundet med tilstedeværelsen af luftfyldte alveolerne, som begrænser den optiske penetration af laser og gøre den slimhinde lag i de intrapulmonary luftveje utilgængelige for i vivo billeddannelse¹⁷ . Omvendt letter strukturen i luftrøret, dannet af en kontinuerlig epitel, billede erhvervelse.

Vi præsenterer her, en protokol, der indeholder en detaljeret beskrivelse af de trin, der kræves for at udføre influenza-infektion, kirurgisk forberedelse af dyrene, og 2P-IVM af luftrøret. Derudover beskriver vi en specifik eksperimentel set-up for visualisering af neutrofile og dendritiske celler (DC), to immun celletyper, der spiller en vigtig rolle som formidlere af forsvarsmekanisme mod influenza virus^18,19 . Endelig, vi beskriver en metode til at analysere neutrofile-DC interaktioner. Disse kontakter har vist sig at modulere DC aktivering og efterfølgende, at påvirke immunrespons mod patogener²⁰.

Protocol

Alle dyr procedurer der involverer mus blev udført i overensstemmelse med de schweiziske føderale Veterinærkontoret retningslinjer og animalske protokoller blev godkendt af de lokale dyrlæge myndigheder. 1. influenza-infektion af CD11c-YFP mus BiosikkerhedBemærk: Mus tilpasset stamme af influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) blev dyrket i befrugtede æg, renset og titreres som tidligere beskrevet21. Alle de trin, der involverer infic…

Representative Results

I dette arbejde beskrev vi en detaljeret protokol til at studere i vivo motilitet og interaktioner mellem neutrofile og DC under influenza-infektion i murine luftrøret (figur 3A). Til dette formål isoleret vi fælles fiskeripolitik+ neutrofile (92% renhed; Figur 3B) fra CK6-ECFP overført mus og vi adoptively dem til en CD11c-YFP musen smittet med influenza. Efter at udførte vi 2P-IVM af luftrøret på dag …

Discussion

Dette arbejde præsenterer en detaljeret protokol for generation af 4D billeder viser migration af adoptively overførte neutrofile og deres interaktioner med DC under et influenza-infektion i mus luftrøret. Den beskrevne 2P-IVM model vil være relevante at studere immun celle dynamics under en infektion i luftvejene.

For nylig, flere modeller baseret på visualisering af celle dynamics i luftvejene har været udviklede^{9,10,</sup…}

Materials

Gigasept instru AF	Schülke & Mayr GmbH		4% solution
CD11c-YFP mice	Jackson Laboratories	008829	mice were bred in-house
CK6-ECFP mice	Jackson Laboratories	004218	mice were bred in-house
1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride	Sigma	D8537-500ML
10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride	Sigma	D1408-500ML
Percoll PLUS	Sigma	E0414-1L	Store at 4°C
Ketamin Labatec	Labatec Pharma	7680632310024	Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin)	Bayer	6293841.00.00	Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak	BD Plastipak	305501
30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes	BD	324826
Falcon 40 µm Cell Strainer	Corning	352340
2 mL Syringes	BD Plastipak	300185
Microlance 3 18 G needles	BD	304622
Introcan Safety 20G (catheter)	Braun	4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster	Costar	3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1X)	ThermoFisher Scientific	42401-018	Store at 4°C
Liberase TL Research Grade	Roche	5401020001	Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I	Amresco (VWR)	0649-50KU	Store at -20°C
CellTrace Violet stain	ThermoFisher Scientific	C34557	Store at -20°C
EDTA	Sigma	EDS-500G
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106	Store at -20°C
PE-10 Micro Medical Tubing	2Biological Instruments SNC	#BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape	M Plast
Viscotears	Bausch & Lomb		Store at RT
Plasticine	Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round	Warner Instruments	64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System	Kent Scientific	SS-01
Nuvo Lite mark 5	GCE medline	14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench)	Tem Sega
SURGICAL BOARD	University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope	LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers	Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective	Olympus	XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller	Life imaging Services
Imaris 9.1.0	Bitplane		Imaging software
GraphPad Prism 7	GraphPad		Statistical software