Анализ вторжения клеток рака и борьбы с метастатическим наркотиков Скрининг с использованием массива гидрогеля микро камеры (HMCA)-на основе плиты
Summary
На основе HMCA изображений пластина представлен для вторжения анализа производительности. Эта пластинка облегчает формирование трехмерной (3D) опухоли сфероидов и измерение раковых клеток вторжения в внеклеточного матрикса (ECM). Квантификация assay вторжения достигается полуавтоматического анализа.
Abstract
Метастазами рака известно причиной 90% рака летальность. Метастазирование представляет собой многоэтапный процесс, который инициирует с нашествия/проникновения опухолевых клеток в соседние ткани. Таким образом вторжение представляет собой решающий шаг в метастазов, делая вторжение процесса исследований и разработок анти метастатического наркотиков, весьма значительный. Для удовлетворения этого спроса, существует необходимость разработки моделей 3D в пробирке , которые имитируют архитектура твердых опухолей и их микроокружения наиболее близко к в естественных условиях государства, с одной стороны, но в то же время быть воспроизводимость, надежные и подходит для высокая урожайность и высокое содержание измерения. В настоящее время, большинство анализов вторжения опереться на сложные microfluidic технологий, которые являются адекватными для научных исследований, но не для большого объема наркотиков скрининг. Другие анализы, с помощью устройств на основе плиты с изолированной отдельных сфероидов в каждой скважине материал потребления и имеют низкий выборки за состояние. Цель нынешнего протокола является обеспечение простой и воспроизводимые biomimetic 3D на основе ячеек системы для анализа потенциала вторжения в больших популяциях опухоли сфероидов. Мы разработали 3D модель для assay вторжения на основе изображений плита HMCA для исследования прорастание опухоли и анти метастатического лекарственных препаратов. Это устройство позволяет производство многочисленных единообразных сфероидов за хорошо (высокая выборки за состояние) окружении компоненты ECM, при этом постоянно и одновременно наблюдения и измерения сфероидов разрешением одного элемента для средних пропускная способность скрининг анти метастатического наркотиков. Эта платформа здесь представлено производство HeLa и MCF7 сфероидов для иллюстрирующих одну ячейку и коллективные вторжения. Мы сравнить влияние ECM компонент гиалуроновой кислоты (HA) на инвазивные способность коллагена, окружающих HeLa сфероидов. Наконец мы представляем Fisetin (вторжения ингибитор) HeLa сфероидов и оксида азота (NO) (вторжения активатор) для MCF7 сфероидов. Проанализированы результаты собственных программное обеспечение, которое позволяет полуавтоматический, простой и быстрый анализ, который облегчает Многопараметрический экспертизы.
Introduction
Смерти рака обусловлено главным образом распространение метастатическим клеток в отдаленные места. Многие усилия в лечении рака сосредоточены на ориентации или предотвращение формирования метастатического колоний и прогрессирования системных метастатической болезни1. Миграции клеток рака является важным шагом в процессе метастазов опухоли, таким образом, исследования рака вторжения Каскад очень важное и необходимое условие для нахождения анти метастатическим терапии.
Было установлено, что использование животных моделей как инструменты для изучения метастатической болезни очень дорого и не всегда представитель опухоли в организме человека. Кроме того внеклеточная микроокружения топологии, механики и состав сильно влияют на поведение клеток рака2. Поскольку в естественных условиях модели по своей сути не имеют возможности отделить и контролировать такие конкретные параметры, которые способствуют рака вторжения и метастазов, существует необходимость для управляемой biomimetic в vitro моделей.
Для того чтобы метастазировать в отдаленные органы, раковые клетки должны exhibit перелетных и инвазивные фенотипических признаков, которые могут быть направлены для терапии. Однако поскольку большинство моделей в vitro рака не имитируют фактические возможности солидных опухолей3, это очень сложно обнаружить физиологически соответствующих фенотипов. Кроме того фенотипической неоднородности, которая существует в пределах опухоли, диктует необходимость анализа миграции опухоли на одного элемента резолюции для того, чтобы обнаружить фенотип направленного лечения, например, путем инициирования метастазирования клеток населения в гетерогенных опухоли4.
Исследование клеток подвижности и коллективной миграции главным образом проводится в монослоя культур клеток эпителия на однородных плоских поверхностей. Эти обычные сотовой модели для миграции клеток рака основаны на анализе населения отдельных ячеек, вторжение через мембраны и компоненты ECM5, но в таких системах, не могут быть внутренние различия между отдельными ячейками изучал. Создание 3D сфероидов, либо через леса или эшафот свободный микро-структур рассматривается как улучшенные средства для изучения опухоли клеток роста и рак вторжения6,,78. Однако большинство 3D систем не подходят для форматов высокой пропускной способности, и взаимодействие между сфероида обычно не могут быть достигнуты, поскольку изолированные индивидуальные сфероидов создаются в каждом микро ну9. Недавние исследования с участием миграции рака основаны на microfluidic приборы3,10,11,12, однако, эти сложные microfluidic инструменты трудны для производства и не может использоваться для высокой пропускной способности, скрининг (HTS) борьбы с инвазивными наркотиков.
Два главных фенотипы, коллективных и индивидуальных клеток миграции, которые играют роль в опухолевых клетках, преодоление барьера ECM и вторжение в соседние ткани, были продемонстрировали13,14, каждый показ различных морфологических характеристики, биохимические, молекулярно-генетических механизмов. Кроме того две формы миграции опухолевых клеток, фибробластов как и Саркодовые, наблюдаются в каждом фенотип. Поскольку оба вторжения фенотипы и режимах миграции, определяются главным образом морфологических свойств, есть потребность сотовых моделей что включить обнаружение на основе изображений и изучение всех форм прорастание опухоли и миграции клеток.
Общая цель текущего метода является обеспечение простой и воспроизводимые biomimetic 3D в vitro на основе ячеек системы для анализа потенциала вторжения в больших популяциях опухоли сфероидов. Здесь мы представляем на основе HMCA 6-ну изображений пластину для исследования прорастание опухоли и анти метастатическим терапии. Эта технология позволяет формирование большого числа сфероидов единообразных 3D опухоли (450 за хорошо) в структуре гидрогеля микро камеры (MC). Различные компоненты ECM добавляются в массив сфероида чтобы вторжения клетки в окружающую среду. Процесс вторжения непрерывно контролируется кратко – и долгосрочной перспективе наблюдения же индивидуальных сфероидов/вторжение клеток и способствует морфологическая характеристика, флуоресцентный окрашивание и поиска конкретных сфероидов в любой точке. Поскольку многочисленные сфероидов разделяют пространство и среднего, возможен взаимодействия через растворимых молекул между отдельными сфероидов и их влияние друг на друга. Анализ полуавтоматический изображения выполняется с помощью собственного кода MATLAB, который позволяет быстрее и эффективнее сбор большого объема данных. Платформа облегчает точную, одновременное измерение многочисленных сфероидов/вторжение клеток в времени-эффективно, позволяя средней пропускной способности скрининга наркотиков анти вторжения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это хорошо документированы, что живые организмы, характеризуются их сложные 3D многоклеточных Организации весьма отличаются от широко используемых 2D монослоя культивируемых клеток, подчеркивая настоятельную необходимость использования сотовой модели, которые лучше имитировать функ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается завещание о Шимон Моше и Джудит Weisbrodt.
Materials
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
Riferimenti
- Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
- Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
- Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
- Lee, E., Song, H. -. H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
- Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
- Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).
- Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).
- Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).
- Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -. R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
- Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
- Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).
- Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
- Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
- Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).
- Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).
- Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).
- Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
- Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Toh, Y. -. C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioingegneria. 5 (2), 29 (2018).
- Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
- Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).
- Lee, S. -. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
- Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
- Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
- Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
- Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
- Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
- Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
- Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
- Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
- Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).
