Synthese en structuurbepaling van µ-Conotoxin PIIIA-isomeren met verschillende Disulfide Connectivities
Summary
Cysteïne-rijke peptides vouwen in verschillende driedimensionale structuren afhankelijk van hun verbindingen bisulfide. Gerichte synthese van individuele bisulfide isomeren is vereist wanneer de buffer oxidatie leidt niet tot de gewenste bisulfide-connectiviteit. Het protocol behandelt de selectieve synthese van peptiden 3-bisulfide-gebonden en hun structurele analyse met behulp van NMR- en MS/MS studies.
Abstract
Peptiden met een groot aantal cysteines zijn het meestal beïnvloed ten aanzien van de driedimensionale structuur door hun bisulfide-connectiviteit. Het is dus zeer belangrijk om te voorkomen dat ongewenste disulfide binding formatie tijdens peptide synthese, omdat het in een volledig verschillende peptide-structuur resulteren kan, en bijgevolg topicale gewijzigd. De juiste vorming van meerdere disulfide bindingen in een peptide is echter moeilijk te verkrijgen met behulp van standaardmethoden zelf vouwen zoals conventionele buffer oxidatie protocollen, omdat verschillende bisulfide connectivities kunnen worden gevormd. Dit protocol vormt een geavanceerde strategie nodig voor de gerichte synthese van meerdere bisulfide-overbrugd peptiden die kan niet worden gesynthetiseerd via buffer oxidatie in hoge kwaliteit en kwantiteit. De studie toont aan de toepassing van een afzonderlijke bescherming strategie van de groep voor de synthese van alle mogelijke 3-bisulfide-verbonden peptide isomeren van µ-conotoxin-PIIIA op een gerichte manier. De peptiden zijn bereid door Fmoc gebaseerde solid phase peptide synthese met behulp van een bescherming strategie van de groep voor gedefinieerde disulfide binding vorming. De respectieve paren van cysteines worden beschermd met trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) en tert-butyl (tBu) beschermen groepen om ervoor te zorgen dat alleen de vereiste cysteines tijdens elke stap van de oxidatie deprotected en gekoppeld. Naast de gerichte synthese, wordt een combinatie van verschillende analytische methoden gebruikt om de juiste folding en generatie van de gewenste peptide structuren te verduidelijken. De vergelijking van de verschillende 3-bisulfide-verbonden isomeren geeft aan het belang van nauwkeurige informatie en kennis van de bisulfide-connectiviteit voor de berekening van de driedimensionale structuur en interpretatie van biologische activiteit van de peptide-isomeren. De karakterisering van het analytische omvat de exacte disulfide binding opheldering via tandem massaspectrometrie (MS/MS) analyse die is uitgevoerd met gedeeltelijk verlaagde en Gealkyleerde derivaten van de intact peptide-isomeer geproduceerd door een aangepast protocol. Bovendien zijn de peptide structuren bepaald met behulp van 2D nucleaire magnetische resonantie (NMR) experimenten en de kennis die zijn verkregen uit MS/MS-analyse.
Introduction
Het gebruik van bioactieve peptiden in farmaceutisch onderzoek en ontwikkeling is zeer erkend, omdat zij krachtige en zeer selectieve compounds voor specifieke biologische doelstellingen1vertegenwoordigen. Voor hun topicale is de driedimensionale structuur echter van groot belang om uit te voeren van de relatie van structuur-activiteit studies2,3,4. Afgezien van de volgorde van het primaire aminozuur die invloed op de algehele bevleesdheid, stabiliseren bisulfide obligaties aanzienlijk de structuur van cysteïne-rijke peptides5. Meerdere bisulfide-overbrugd peptiden omvatten conotoxins zoals µ-PIIIA van de Conus purpurascens waarin zes cysteines in zijn reeks. Deze hoge cysteïne-inhoud kunt theoretisch de vorming van 15 bisulfide isomeren. De juiste bisulfide-connectiviteit is heel belangrijk voor de biologische activiteit6,7. Echter, de vraag die rijst is of er meer dan één bioactieve conformatie van nature voorkomende peptides en als zo, welke van die isomeren de hoogste biologische activiteit bezit? In het geval van µ-conotoxins, de biologische doelstellingen zijn natrium spanning-gated ionenkanalen en µ-PIIIA in het bijzonder is meest potente voor subtypen nbV1.2, nbV1.4 en nbV1.73.
De synthese van peptiden bisulfide-overbrugd kan worden bereikt met behulp van verschillende methoden. De meest geschikte methode voor de vorming van disulfide bindingen binnen een peptide is de zogenaamde oxidatieve zelf vouwen benadering. Hier wordt de lineaire voorloper van de gewenste cyclisch peptide gesynthetiseerd eerst met behulp van solid-phase peptide synthese, die immers het splijten van de polymere steun onderworpen aan oxidatie in een buffersysteem. Redox-actieve agentia zoals verminderde en geoxideerd glutathion (GSH/GSSG) worden vaak toegevoegd ter bevordering van de vorming van de disulfide bindingen. Het grootste nadeel van de buffer-ondersteund zelf vouwen is dat de disulfide bindingen niet selectief worden gevormd op een stapsgewijze manier. In vergelijking met de inheemse peptide, waarvoor vaak slechts één specifieke bisulfide isomeer wordt beschreven, is het mogelijk om talrijke andere isomeren met deze aanpak8. µ-PIIIA is reeds aangetoond dat resulteren in ten minste drie anders gevouwen isomeren op zelf in een eerdere studie3vouwen. De scheiding van dergelijke een mengsel van isomeer is nogal moeilijk als gevolg van soortgelijke retentietijden als chromatografische zuivering methoden9gebruikt. De gerichte synthese van een specifiek isomeer is dus gunstig. Specifiek producten die een isomeer met gedefinieerde bisulfide connectiviteit, een speciale strategie nodig is die de bisulfide obligaties zijn achtereenvolgens gesloten. Daarom wordt de lineaire voorloper uitvoering van verschillende beschermen groepen in de individuele cysteïne pairs gesynthetiseerd op de steun van het polymeer. Na de verwijdering, de cysteïne-paren zijn individueel en achtereenvolgens deprotected en verbonden in een oxidatie-reactie op de opbrengst van de gewenste bisulfide obligaties10,11,12,13, 14 , 15 , 16. na de synthese en de zuivering van het reactieproduct, dat is vereist ter bevestiging van de identiteit en de connectiviteit bisulfide geschikte analysemethoden. Tal van analytische methoden zijn beschikbaar voor de opheldering van de volgorde van de primaire aminozuur, bijv., MS/MS, terwijl de bepaling van de bisulfide-connectiviteit is nog steeds veel minder onderzocht. Afgezien van de complexiteit van dergelijke meerdere bisulfide-gebonden peptides, productgerelateerde onzuiverheden (bv., van bisulfide versluiering), als gevolg van monster voorbereiding en werk-up kunnen verder compliceren analyse. In dit artikel laten we zien dat het gebruik van een combinatie van verschillende analytische technieken nodig is om de identiteit van de disulfide bindingen in de µ-PIIIA-isomeren ondubbelzinnig te verduidelijken. Wij hebben chromatografische methoden gecombineerd met massaspectrometrie en verstrekt de zelfde monsters naar NMR spectroscopie. In de laser matrix-bijgewoonde desorption/ionization(MALDI) MS/MS-analyse geïdentificeerd we de disulfide bindingen met behulp van gedeeltelijke vermindering en iodoacetamide bewerking omdat top-down analyse niet mogelijk voor dit peptide is. 2D NMR experimenten werden uitgevoerd met het oog op een driedimensionale structuur van elke isomeer. Door het combineren van verschillende geavanceerde analytische methoden, is het dus mogelijk ophelderen goed de bisulfide connectiviteit en de driedimensionale structuur van complex meerdere bisulfide-gebonden peptiden7.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven methode hierin voor de synthese van cysteïne-rijke peptides zoals µ-PIIIA vertegenwoordigt een mogelijkheid tot selectief bisulfide-gebonden isomeren van dezelfde aminozuur volgorde. Daarom, gevestigde methoden zoals Fmoc gebaseerde solid phase peptide synthese18 en een gedefinieerde bescherming strategie van de groep voor de regioselectieve vorming van disulfide bindingen waren gebruikte16. De solid-phase peptide synthese kan produceren aminozuur sequenties…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zouden graag willen bedanken A. Resemann, F. J. Mayer en D. Suckau van Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts en C. Thiele uit de Darmstadt University of Technology; O. Ohlenschläger van het FLI-Jena, M. Engeser van de Universiteit van Bonn; K. Kramer, A. Harzen en H. Nakagami van het Max Planck Instituut voor fok plantenonderzoek, Keulen; Susanne Neupert van het Instituut voor Dierkunde, Keulen; Biomoleculaire magnetische resonantie spectroscopie faciliteiten van de Universiteit van Frankfurt voor technische ondersteuning, modules, opleiding en toegang tot instrumenten. Financiële steun van de Universiteit van Bonn aan D.I. wordt dankbaar erkend.
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
Riferimenti
- Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
- Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie – International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
- Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie – International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
- Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
- Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
- Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
- Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochimica. 50 (17), 3414-3431 (2011).
- Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
- Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
- Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
- Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
- Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
- Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
- Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
- Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
- Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
- Kates, S. A., Albericio, F. . Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).
- Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie – International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).
