Síntesis y determinación estructural de μ-Conotoxina PIIIA isómeros con disulfuro diferentes conectividades
Summary
Péptidos ricos en cisteína doblan en estructuras tridimensionales distintas dependiendo de la conectividad de disulfuro. Específicas síntesis de isómeros individuales disulfuro es necesario oxidación de búfer no conduce a la conectividad deseada disulfuro. El protocolo aborda la síntesis selectiva de péptidos 3-disulfuro-consolidado y su análisis estructural mediante estudios NMR y MS/MS.
Abstract
Péptidos con un elevado número de cisteínas son influenciados generalmente con respecto a la estructura tridimensional por su conectividad de disulfuro. Por lo tanto es muy importante para evitar la formación de Enlace disulfuro no deseados durante la síntesis de péptidos, porque puede dar lugar a una estructura completamente diferente de péptidos y en consecuencia alterado bioactividad. Sin embargo, la correcta formación de múltiples enlaces de disulfuro en un péptido es difícil de obtener mediante métodos auto plegables estándar tales como protocolos de la oxidación del tampón convencional, porque pueden formar varias conectividades de disulfuro. Este protocolo representa una avanzada estrategia necesaria para la síntesis específica de múltiples péptidos puente disulfuro que no pueden ser sintetizados vía oxidación de búfer en alta calidad y cantidad. El estudio demuestra la aplicación de una estrategia de grupo protección distinta para la síntesis de todos los isómeros posibles péptidos 3-disulfuro-consolidado de μ-Conotoxina PIIIA una manera específica. Los péptidos son preparados por síntesis de péptidos de fase sólida basado en el Fmoc utilizando una estrategia de protección del grupo para la formación del Enlace disulfuro definida. Los respectivos pares de cisteínas están protegidos con trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) y terc-butilo (tBu) proteger grupos para asegurarse de que durante cada paso de oxidación sólo las cisteínas requiere deprotected y vinculados. Además la síntesis específica, una combinación de varios métodos analíticos se usa para aclarar el plegamiento correcto y la generación de las estructuras de péptido deseado. La comparación de los diferentes isómeros 3-disulfuro-consolidado indica la importancia de la determinación precisa y el conocimiento de la conectividad de disulfuro para el cálculo de la estructura tridimensional y para la interpretación de lo biológico actividad de los isómeros del péptido. La caracterización analítica incluye la aclaración de Enlace disulfuro exacta vía análisis de espectrometría de masas (MS/MS) de tándem que se realiza con derivados alkylated y parcialmente reducidos del isómero intactas péptido producido por un protocolo adaptado. Además, las estructuras de péptidos se determinan mediante experimentos 2D de resonancia magnética nuclear (RMN) y el conocimiento obtenidos del análisis MS/MS.
Introduction
El uso de péptidos bioactivos en investigación farmacéutica y desarrollo es altamente reconocido, debido a que representan compuestos potentes y altamente selectivos para objetivos biológicos específicos1. Para su bioactividad, sin embargo, la estructura tridimensional es de gran importancia para realizar la estructura y actividad relación estudios2,3,4. Aparte de la secuencia primaria del aminoácido que influye en la conformación general, enlaces de disulfuro estabilizan significativamente la estructura de péptidos ricos en cisteína5. Varios péptidos puente disulfuro incluyen conotoxinas como μ-PIIIA de Conus purpurascens que contiene seis cisteínas en su secuencia. Este contenido de cisteína alta permite teóricamente la formación de 15 isómeros de disulfuro. La conectividad de disulfuro correcto es muy importante para la actividad biológica6,7. ¿Sin embargo, la pregunta que surge es si existe más de una conformación bioactivo péptidos naturalmente y si por lo tanto, cuál de los isómeros posee la más alta actividad biológica? En el caso de μ-conotoxinas, los blancos biológicos son canales de sodio voltaje-bloqueado del ion, y μ-PIIIA en particular es más potente para los subtipos de NaV1.2, NaV1.4 y NaV1.73.
La síntesis de péptidos puente disulfuro puede lograrse usando varios métodos. El método más conveniente para la formación de enlaces disulfuro dentro de un péptido es el llamado enfoque auto plegable oxidativo. Aquí, el precursor lineal del péptido cíclico deseado se sintetiza primero usando la síntesis de péptidos de fase sólida, que es después de la ruptura del soporte polimérico sometidos a oxidación en un sistema de buffer. Agentes redox activos como el glutation reducido y oxidado (GSH/GSSG) se agregan a menudo para promover la formación de los enlaces de disulfuro. La principal desventaja de buffer compatible auto plegable es que los enlaces de disulfuro se forman no selectivamente de manera gradual. Comparado con el péptido nativo, que a menudo isómero disulfuro específica solo se describe, es posible obtener numerosos otros isómeros con este enfoque8. Μ-PIIIA ya se ha demostrado para dar lugar a isómeros diferentemente doblados por lo menos tres a uno plegable en un anterior estudio3. La separación de una mezcla de isómero es algo difícil debido a los tiempos de retención similares si el uso de métodos de purificación cromatográfica9. La síntesis específica de un isómero específico, por tanto, es ventajosa. En concreto produce que un isómero con conectividad de disulfuro definido, una estrategia especial se requiere que el disulfuro de bonos sucesivamente están cerrados. Por lo tanto, el precursor lineal llevando grupos distintos de protección en los pares individuales de cisteína se sintetiza en el soporte de polímero. Después de la eliminación, los pares de cisteína individual y sucesivamente deprotected y vinculados en una reacción de oxidación para producir la deseada disulfuro bonos10,11,12,13, 14 , 15 , 16. después de la síntesis y la purificación del producto de la reacción, es necesaria para confirmar la identidad y la conectividad de disulfuro por métodos analíticos apropiados. Numerosos métodos analíticos están disponibles para la elucidación de la secuencia primaria de aminoácidos, por ejemplo., MS/MS, mientras que la determinación de la conectividad de disulfuro sigue siendo mucho menos investigada. Aparte de la complejidad de tales múltiples péptidos disulfuro-consolidado, impurezas relacionadas con el producto (ej., de disulfuro el revolver), debido a la muestra de preparación y el work-up pueden complicar más análisis. En este trabajo, nos muestran que el uso de una combinación de diferentes técnicas analíticas es necesario aclarar inequívocamente la identidad de los enlaces de disulfuro en los isómeros de μ-PIIIA. Hemos combinado métodos de cromatografía con espectrometría de masas y siempre las mismas muestras para espectroscopia de RMN. En desorption/ionization(MALDI) láser asistida por matriz de análisis MS/MS, identificamos el disulfuro mediante reducción parcial y derivatización de Yodoacetamida porque análisis de arriba hacia abajo no es posible que este péptido. Se realizaron experimentos de NMR 2D para obtener una estructura tridimensional de cada isómero. Así, combinando distintos métodos analíticos sofisticados, es posible dilucidar adecuadamente el disulfuro conectividad y estructura tridimensional del complejo de múltiples péptidos disulfuro-consolidado7.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito en este documento para la síntesis de péptidos ricos en cisteína como μ-PIIIA representa una posibilidad para producir selectivamente disulfuro-consolidado isómeros de la misma secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, estableció métodos como sólida base de Fmoc fase de síntesis de péptido18 y una estrategia de grupo de protección definida para la formación regioselectiva de disulfuro fueron utilizadas16. La síntesis del peptide de la fase s?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a A. Resemann, F. J. Mayer y D. Suckau de Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts y Thiele C. de la Universidad Tecnológica de Darmstadt; O. Ohlenschläger de la Jena FLI, M. Engeser de la Universidad de Bonn; K. Kramer, A. Harzen y H. Nakagami del Instituto Max Planck para la investigación de crianza de planta, Colonia; Susanne Neupert del Instituto de Zoología de la Colonia; y las instalaciones de espectroscopia de resonancia magnética Biomolecular de la Universidad de Francfort para técnico soporte, módulos, de formación y acceso a instrumentos. Se agradece el apoyo financiero de la Universidad de Bonn a D.I..
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
Riferimenti
- Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
- Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie – International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
- Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie – International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
- Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
- Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
- Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
- Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochimica. 50 (17), 3414-3431 (2011).
- Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
- Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
- Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
- Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
- Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
- Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
- Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
- Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
- Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
- Kates, S. A., Albericio, F. . Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).
- Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie – International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).
