Un protocollo per la delucidazione della pianta thylakoid proteina complessa organizzazione e composizione con blu nativo poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) e 2D-SDS-PAGE è descritto. Il protocollo è ottimizzato per Arabidopsis thaliana, , ma può essere utilizzato per altre specie di piante con modifiche minori.
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Articolo metodologico
Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu
In questo articolo
Sommario
Abstract
Catena di trasporto fotosintetiche dell'elettrone (ecc) converte energia solare in energia chimica sotto forma di NADPH e ATP. Quattro complessi proteici grande incorporato nell'energia solare raccolta membrana tilacoide per guidare gli elettroni dall'acqua a NADP+ via due fotosistema e utilizzare la pendenza del protone creato per la produzione di ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b6f (Cyt b6f) e dell'atpasi sono tutti i complessi multiproteici con orientamento distinto e dinamiche nella membrana tilacoide. Preziose informazioni circa la composizione e le interazioni dei complessi della proteina nella membrana tilacoide ottenibile da solubilizzare i complessi dall'integrità della membrana di detergenti delicati, seguite dalla separazione elettroforetica di Natale del gel della complessi. L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo analitico utilizzato per la separazione dei complessi della proteina nella loro forma nativa e funzionale. Il metodo può essere utilizzato per la purificazione della proteina di complessi per più dettagliata analisi strutturale, ma fornisce anche uno strumento per analizzare le interazioni dinamiche tra i complessi di proteine. Il metodo è stato sviluppato per l'analisi dei complessi della proteina respiratoria mitocondriale, ma da allora ha stato ottimizzato e migliorato per la dissezione dei complessi proteici thylakoid. Qui, forniamo un dettagliato protocollo sono aggiornato per l'analisi di complessi proteici fotosintetici labile e le loro interazioni in Arabidopsis thaliana.
Introduzione
Grande proteina del multisubunit complessi fotosistema PSI e PSII, Cyt b6f e dell'atpasi coordinare la produzione di ATP e NADPH in reazioni fotosintetiche di luce. Nei cloroplasti di piante superiori, i complessi si trovano nella membrana tilacoide, che è una struttura a membrana strutturalmente eterogenee, che comprende appressed grana e lo stroma non appressed tilacoidi. L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo ampiamente usato nell'analisi dei complessi della proteina del multisubunit grande nella loro forma nativa e biologicamente attivo. Il metodo è stato istituito per la dissezione della membrana mitocondriale della....
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Protocollo
1. preparazione BN Gel1,2,3
- Impostare la colata di gel con piastre di 8 x 10 cm (rettangolare in vetro e piastra dentellata allumina) secondo le istruzioni del produttore mediante distanziali di 0,75 mm.
- Posizionare un gradiente mixer su un piatto di mescolare e collegarlo con la pompa peristaltica di una tubazione. Collegare una siringa a altra estremità del tubo e inserire l'ago tra la piastra di vetro e alluminio. Agitatore magnetico posto il "pesante" (H)-camera.
- Preparare il 3,5% (v/v) e del 12,5% (v/v) solu....
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Risultati
Un sistema rappresentativo di 2D-BN/SDS-PAGE nella Figura 1 viene illustrato la separazione della digitonina e complessi della proteina β-DM-solubilizzato thylakoid e loro composizione in subunità della proteina dettagliate. Il modello complesso della proteina di digitonina solubilizzata tilacoidi (gel orizzontale in alto a sinistra sulla cima di Figura 1A) contiene PSII-LHCII-PSI megacomplex, due grandi supercomplessi di PSII-LH.......
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Discussione
I macchinari di conversione di energia fotosintetica sono composto da complessi di grande proteina del multisubunit, che sono incorporati nella membrana tilacoide. Questo protocollo descrive un metodo di base per l'analisi dei complessi proteici thylakoid pianta Arabidopsis thaliana con BN-PAGE combinato con 2D-SDS-PAGE. Il protocollo è adatto anche per l'analisi dei complessi della proteina thylakoid da tilacoidi tabacco e spinaci, ma potrebbe richiedere piccoli aggiustamenti.
Per la.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente dall'Accademia di Finlandia (numeri di progetto 307335 e 303757) ed energia solare nell'accordo di sovvenzione di biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Il protocollo si basa sul riferimento3.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido 6-aminocaproico (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrilammide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Attenzione: Neurotossico! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glicerolo | J.T. Baker | 7044 | |
| Fluoruro di sodio (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA sale disodico | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Attenzione:Tossico! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoetanolo | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Persolfato di ammonio) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetrametiletilendiammina) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Metilene)-Bis-acrilammide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Marcatore di proteine predefinite, ampia gamma (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, provette da centrifuga coniche 15 ml | Corning | 352093 | |
| Doppia ruota in gel con piastre da 10 x 8 cm | Hoefer | SE215 | |
| Creatore di gradienti SG5 | Hoefer | ||
| Distanziatori a T da 0,75 mm | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Pettine per gel per campioni, 0,75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Sistema di elettroforesi verticale Mighty Small SE250 | Hoefer | SE250 | |
| Alimentatore | Ismatec | ||
| , Centrifuga PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Eppendorf | 5424R | ||
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
| br/> PROTEAN II xi Cell | Bio-Rad | 1651813 |
Riferimenti
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN....
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Ristampe e permessi
