Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Summary

Un protocollo per la delucidazione della pianta thylakoid proteina complessa organizzazione e composizione con blu nativo poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) e 2D-SDS-PAGE è descritto. Il protocollo è ottimizzato per Arabidopsis thaliana, , ma può essere utilizzato per altre specie di piante con modifiche minori.

Abstract

Catena di trasporto fotosintetiche dell'elettrone (ecc) converte energia solare in energia chimica sotto forma di NADPH e ATP. Quattro complessi proteici grande incorporato nell'energia solare raccolta membrana tilacoide per guidare gli elettroni dall'acqua a NADP⁺ via due fotosistema e utilizzare la pendenza del protone creato per la produzione di ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b₆f (Cyt b₆f) e dell'atpasi sono tutti i complessi multiproteici con orientamento distinto e dinamiche nella membrana tilacoide. Preziose informazioni circa la composizione e le interazioni dei complessi della proteina nella membrana tilacoide ottenibile da solubilizzare i complessi dall'integrità della membrana di detergenti delicati, seguite dalla separazione elettroforetica di Natale del gel della complessi. L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo analitico utilizzato per la separazione dei complessi della proteina nella loro forma nativa e funzionale. Il metodo può essere utilizzato per la purificazione della proteina di complessi per più dettagliata analisi strutturale, ma fornisce anche uno strumento per analizzare le interazioni dinamiche tra i complessi di proteine. Il metodo è stato sviluppato per l'analisi dei complessi della proteina respiratoria mitocondriale, ma da allora ha stato ottimizzato e migliorato per la dissezione dei complessi proteici thylakoid. Qui, forniamo un dettagliato protocollo sono aggiornato per l'analisi di complessi proteici fotosintetici labile e le loro interazioni in Arabidopsis thaliana.

Introduction

Grande proteina del multisubunit complessi fotosistema PSI e PSII, Cyt b₆f e dell'atpasi coordinare la produzione di ATP e NADPH in reazioni fotosintetiche di luce. Nei cloroplasti di piante superiori, i complessi si trovano nella membrana tilacoide, che è una struttura a membrana strutturalmente eterogenee, che comprende appressed grana e lo stroma non appressed tilacoidi. L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo ampiamente usato nell'analisi dei complessi della proteina del multisubunit grande nella loro forma nativa e biologicamente attivo. Il metodo è stato istituito per la dissezione della membrana mitocondriale della....

Protocol

1. preparazione BN Gel^1,2,3

1. Impostare la colata di gel con piastre di 8 x 10 cm (rettangolare in vetro e piastra dentellata allumina) secondo le istruzioni del produttore mediante distanziali di 0,75 mm.
2. Posizionare un gradiente mixer su un piatto di mescolare e collegarlo con la pompa peristaltica di una tubazione. Collegare una siringa a altra estremità del tubo e inserire l'ago tra la piastra di vetro e alluminio. Agitatore magnetico posto il "pesante" (H)-camera.
3. Preparare il 3,5% (v/v) e del 12,5% (v/v) solu....

Results

Un sistema rappresentativo di 2D-BN/SDS-PAGE nella Figura 1 viene illustrato la separazione della digitonina e complessi della proteina β-DM-solubilizzato thylakoid e loro composizione in subunità della proteina dettagliate. Il modello complesso della proteina di digitonina solubilizzata tilacoidi (gel orizzontale in alto a sinistra sulla cima di Figura 1A) contiene PSII-LHCII-PSI megacomplex, due grandi supercomplessi di PSII-LH.......

Discussion

I macchinari di conversione di energia fotosintetica sono composto da complessi di grande proteina del multisubunit, che sono incorporati nella membrana tilacoide. Questo protocollo descrive un metodo di base per l'analisi dei complessi proteici thylakoid pianta Arabidopsis thaliana con BN-PAGE combinato con 2D-SDS-PAGE. Il protocollo è adatto anche per l'analisi dei complessi della proteina thylakoid da tilacoidi tabacco e spinaci, ma potrebbe richiedere piccoli aggiustamenti.

Per la.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acido 6-aminocaproico (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389
Acrilammide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Attenzione: Neurotossico!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glicerolo	J.T. Baker	7044
Fluoruro di sodio (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA sale disodico	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Attenzione:Tossico!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoetanolo	Bio-Rad	1610710
APS (Persolfato di ammonio)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetrametiletilendiammina)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Metilene)-Bis-acrilammide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Marcatore di proteine predefinite, ampia gamma (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, provette da centrifuga coniche 15 ml	Corning	352093
Doppia ruota in gel con piastre da 10 x 8 cm	Hoefer	SE215
Creatore di gradienti SG5	Hoefer
Distanziatori a T da 0,75 mm	Hoefer	SE2119T-2-.75
Pettine per gel per campioni, 0,75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Sistema di elettroforesi verticale Mighty Small SE250	Hoefer	SE250
Alimentatore	Ismatec
, Centrifuga PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
br/> PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813