En Hyperandrogenic musmodell att studera polycystiskt ovariesyndrom
Summary
Vi beskriver utvecklingen av en lean PCOS-liknande musmodell med dihydrotestosteron pellets att studera patofysiologin av PCOS och avkomman från dessa PCOS-liknande dammar.
Abstract
Hyperandrogenemia spelar en avgörande roll i reproduktiv och metabola funktion hos kvinnor och är kännetecknande för polycystiskt ovariesyndrom. Utveckla en lean PCOS-liknande musmodell som härmar kvinnor med PCOS är kliniskt betydelsefull. I detta protokoll beskriver vi en sådan modell. Genom att sätta in en 4 mm längd av DHT (dihydrotestosteron) kristall pulver pellet (Totallängd pellet är 8 mm), och ersätta det varje månad, har vi möjlighet att producera en PCOS-liknande musmodell med serum DHT nivåer 2 gånger högre än möss inte implanteras med DHT (nr-DHT). Vi observerade reproduktiv och metabolisk dysfunktion utan att ändra kroppsvikt och kroppssammansättning. Samtidigt uppvisar en hög grad av infertilitet, en liten delmängd av dessa PCOS-liknande honmöss kan bli gravid och deras avkomma Visa försenad pubertet och ökad testosteron som vuxna. Detta PCOS-liknande musmodell för lean är ett användbart verktyg att studera patofysiologin av PCOS och avkomman från dessa PCOS-liknande dammar.
Introduction
Hyperandrogenism är kännetecknet av polycystiskt ovariesyndrom (PCOS) enligt NIH kriterier och Androgen överskott och PCOS (AE-PCOS) samhälle. Kvinnor med PCOS har svårigheter att bli gravid och har ökad risk för graviditet komplikationer1. Även om de blir gravida, har deras kvinnliga avkommor en negativa hälsoeffekter utfall2,3. Djurmodeller har utvecklats med hjälp av olika strategier4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 och uppvisar många funktioner av PCOS (anovulation, och eller nedsatt glukos och insulin tolerans) med ökad kroppsvikt och fetma som är associerad med utvidgade fettceller storlek och ökad fettceller vikt. Det finns två stora strategier att producera djurmodeller som används för att studera PCOS. En är behandling med höga nivåer av androgener direkt (exogena androgen injektion/insertion) eller indirekt (till exempel blockera androgen konvertering till östrogen med aromatashämmare) efter födelse13. En annan är av fostrets hyperexposure av androgener under dräktigheten14,15 studera avkomman. Till exempel utvecklas kvinnliga avkommor från Rhesusapa16,17, får18och gnagare som utsätts för manliga nivåer av androgen i intrauterin perioden PCOS-liknande drag senare i livet. Dessa modeller förbättrats avsevärt vår förståelse av förhöjda androgena effekter, och fetal programmering, och livmoder miljöeffekter. Dessa modeller har dock sina egna begränsningar: 1) djur utvecklar fetma och det är därför svårt att skilja effekterna av hyperandrogenemia från fetma inducerad reproduktiv och metabolisk dysfunktion; (2) före graviditet, kvinnor med PCOS uppvisar redan höga nivåer av androgen, således oocyter har exponerats för androgen överskott före befruktningen; (3) de farmakologiska doserna av testosteron (T) eller dihydrotestosteron (DHT) användas efter födseln eller under dräktigheten kanske inte återspeglar androgen miljö av PCOS. Testosteron och DHT nivåer har mätts i äggstockarna follikulära vätska och/eller serum, och testosteron och DHT nivåer är 1,5-3,9 gånger högre hos kvinnor med PCOS5,19,20,21 ,22,23 jämfört med opåverkade kvinnor. Vi skapade en vuxen mus modell23,24,25 som utvecklar reproduktiv och metabolisk dysfunktion inom två veckor efter inledandet av kronisk DHT exponering från införandet av en pellet med 4 mm längd Crystal DHT pulver (Totallängd pellet är 8mm). Denna modell producerar DHT-nivåerna i serum som är om 2-faldigt högre (kallad 2xDHT) än för kontroll möss utan DHT behandling. 2xDHT möss inte uppvisar förändringar av basala serum estradiol, testosteron, LH och inte utveckla övervikt och Visa liknande ovarial vikt, serumnivåer av kolesterol, fria fettsyror, leptin, TNFα och IL-623,24, 25 förhållande till styr ända upp till 3,5 månader efter DHT införande23,24,25. Dessutom, genom parning honor som redan har utvecklat funktioner av PCOS, kan vi studera effekterna av en hyperandrogenic maternell miljö på den metabola och reproduktiv hälsan avkommor15.
Detta nya paradigm (relevant för NIH och AE-PCOS samhället kriterier) modeller sjukdomen genom att producera relativt liknande nivåer av androgener till de av kvinnor med PCOS 2 – till 3-faldigt högre testosteron eller DHT nivåer jämfört med opåverkade kvinnor. Men upprätthålls denna modell av ständiga exogena DHT och inte från programmerade endogena hyperandrogenism när DHT dras. Det övergripande målet med denna artikel är att fokusera på 1) hur man gör DHT pelleten; (2) hur man skapar en lean-PCOS som musmodell; (3) strategier för att utvärdera kvinnliga avkommor från dessa dammar. Andra mätningar och bedömning av fenotyper behandlas inte i detta manuskript men kan hittas i5,15,23,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hyperandrogenism är en nyckelfunktion i PCOS. De DHT nivåerna i serum (två gånger högre i DHT möss än hos nr-DHT möss) används i detta protokoll är lägre än de som rapporterats av andra utredare i tidigare studier och är kalibrerade för att proportionellt efterlikna kvinnor med PCOS5,19, 20,21. Till skillnad från andra modeller ändrar inte denna 2-faldig DHT-modell av kroppsvik…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (bidrag R00-HD068130 att S.V.) och Baltimore Diabetes Research Center: piloter och genomförbarhet Grant (att S.V.).
Materials
| Crystalline 5α-DHT powder | Sigma-Aldrich | A8380-1G | ||
| Dow Corning Silastic tubing | Fisher Scientific | 11-189-15D | 0.04in/1mm inner diameter x0.085in/2.15mm outer diameter | |
| Medical adhesive silicone | Factor II, InC. | A-100 | ||
| Goggles, lab coats, gloves and masks. | ||||
| 10 µL pipette tips without filter | USA Scientific | 11113700 | ||
| Microscope slide for smear | Fisher Scientific | 12-550-003 | ||
| Diff Quik for staining cells | Fisher Scientific | NC9979740 | ||
| Lancet | Fisher Scientific | NC9416572 | ||
| 3 mL Syring | Becton, Dickinson and Company (BD), | 30985 | ||
| attached needle: 20G | BD | 305176 | ||
| Ruler: any length than 10cm with milimeter scale. | ||||
| Xylazine | Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise | NDC13985-704-10 | 100mg/ml | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira, Inc | NDC 0409-2051-05 | 100mg/ml | |
| Surgical staple | AutoClip® System, Fine Science Tool | 12020-00 | ||
| Insulin syringe | BD | 329461 | 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe | |
| Trochar | Innovative Research of America | MP-182 | ||
| Microscope | Carl Zeiss Primo Star | 415500-0010-001 | Germany | |
| Ear punch | Fisher Scientific | 13-812-201 | ||
| Testosterone rat/mouse ELISA kit | IBL | B79174 | ||
| DHT ELISA kit | Alpha Diagnostic International | 1940 | ||
| One touch ultra glucometer | Life Scan, Inc. | |||
| One touch ultra test stripes | Life Scan, Inc. | |||
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-18 | ||
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | ||
| Clidox | Fisher Scientific | NC0089321 | ||
| surgical underpad | Fisher Scientific | 50587953 | 
|
|
| Betadine Antiseptic Solution | Walgreens | |||
| 3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) | 3M Science. Applied to Life | |||
| Animal tattoo ink paste | Ketchum manufacturing Inc. | Brockville, Ontario, Canada | ||
| Scale | Ohaus Corporation | HH120D | Pine Brook, NJ | |
| Electronic digital caliper | NEIKO Tools USA | 01407A | available from Amazon |
Riferimenti
- Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
- Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125 (6), 1397-1406 (2015).
- de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. , (2018).
- Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
- van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153 (6), 2861-2869 (2012).
- Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102 (3), 226-237 (2015).
- Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8 (2), 127-141 (2007).
- Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93 (3), 69 (2015).
- Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509 (2016).
- Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35 (2), 103-108 (2004).
- Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32 (3), 183-193 (2014).
- Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8 (2), 103-115 (2011).
- Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93 (3), 69 (2015).
- Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS?. Hum. Reprod. Update. 23 (4), 421-432 (2017).
- Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159 (2), 1242-1252 (2018).
- Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome?. Hum. Reprod. Update. 11 (4), 357-374 (2005).
- Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome – a hypothesis. J. Endocrinol. 174 (1), 1-5 (2002).
- Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373 (1-2), 8-20 (2013).
- Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102 (11), (2017).
- Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101 (11), 4178-4188 (2016).
- Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (6), 2760-2766 (2003).
- Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279 (3), 321-327 (2009).
- Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. , en20161608 (2016).
- Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. , en20161553 (2016).
- Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314 (4), E353-E365 (2018).
- van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function?. Reprod. Biol. 14 (1), 32-43 (2014).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. , (2009).
- Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28 (10), 1670-1681 (2014).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
- Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156 (7), (2015).
- McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).
- Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).
- Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).
