Qui, si condividono i metodi di misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale, un concetto di definizione di energetica nutrizionale e perdita di protone, la causa primaria di inefficienza nella generazione mitocondriale di ATP. Questi risultati possono rappresentare 30% di energia perdita nell'utilizzazione dei nutrienti per aiutare a valutare la funzione mitocondriale.
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Articolo metodologico
Misurazione del consumo dell'ossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte Holstein
In questo articolo
Sommario
Abstract
Consumo di ossigeno, (PMF) della forza motrice protonica e perdita del protone sono misurazioni di respirazione mitocondriale, o quanto bene i mitocondri sono in grado di convertire NADH e FADH in ATP. Poiché i mitocondri sono anche il luogo primario per l'uso di ossigeno e nutrienti ossidazione ad anidride carbonica e acqua, quanto efficientemente usano ossigeno e produrre ATP direttamente riguarda l'efficienza del metabolismo dei nutrienti, esigenze nutrizionali dell'animale, e salute dell'animale. Lo scopo di questo metodo è quello di esaminare la respirazione mitocondriale, che può essere utilizzata per esaminare gli effetti di diversi farmaci, le diete e gli effetti ambientali sul metabolismo mitocondriale. I risultati includono consumo di ossigeno misurato come respirazione dipendente protone (stato 3) e protone perdita dipendente respirazione (stato 4). Il rapporto della respirazione 4 3 / stato stato è definito come rapporto di controllo respiratorio (RCR) e può rappresentare l'efficienza energetica mitocondriale. Perdita di mitocondriale del protone è un processo che permette la dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP) da disgiungere fosforilazione ossidativa da ADP diminuendo l'efficienza della sintesi di ATP. Ossigeno e TRMP + elettrodi sensibili con substrati mitocondriali e inibitori della catena di trasporto degli elettroni sono utilizzati per misurare State 3 e 4 di stato respirazione, membrana mitocondriale PMF (o il potenziale di produrre l'ATP) e perdita del protone. Limitazioni a questo metodo sono che il tessuto del fegato deve essere più fresco possibile e tutte le biopsie e le analisi devono essere eseguite in meno di 10 ore. Questo limita il numero di campioni che possono essere raccolti ed elaborati da una sola persona in un giorno per circa 5. Tuttavia, è necessario solo 1 g di tessuto del fegato, quindi in grandi animali, come bovini da latte, la quantità di campione necessaria è piccola rispetto alle dimensioni del fegato e c'è poco tempo di recupero necessario.
Introduzione
I mitocondri sono molto sensibili allo stress e loro ambiente cellulare può contribuire a una vasta gamma di malattie metaboliche. Consumo di ossigeno e perdita di protoni in mitocondri sono indicatori della salute di mitocondri. I metodi descritti in questa efficienza energetica mitocondriale di carta stima utilizzando RCR basano sul consumo di ossigeno con e senza perdita di protoni. Questi risultati possono rappresentare 30% dell'energia perdita in utilizzazione nutriente1. Cambiamenti nella perdita del protone e consumo di ossigeno possono identificare la disfunzione mitocondriale che contribuisce alla malattia metabolica e si traduce in un....
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Protocollo
Tutti i metodi, protocollo e studi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of California, Davis.
1. ottenere una biopsia del fegato da una mucca da latte dell'Holstein
Nota: Una biopsia del fegato deve essere eseguita da un veterinario autorizzato. Le biopsie del fegato possono essere eseguite sul sito latteria dove si trovano le mucche. Vacche da latte in lattazione possono continuare a essere munte normalmente e latte non deve necessariamente essere ritirata dall'approvvigionamento di cibo, prima o dopo la procedura. È consigliabile che almeno 4 pe....
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Risultati
Risultati positivi risultati RCR e protone perdita cinetica sono mostrati in tabella 1 e Figura 15, rispettivamente. In questo studio7, RCR e proteina perdita cinetica sono stati misurati in vacche Holstein a 70 giorni nel latte dopo le mucche erano state alimentate 1 di 5 diversi livelli di Cu, Zn e Mn per 28 giorni. Stato 4, respirazione di protone massima perdita-dipendente, aveva la tendenza a essere influenzato da.......
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Discussione
Il punto più critico nel protocollo è ottenere un campione rappresentativo del tessuto del fegato e cominciando l'isolamento dei mitocondri più presto possibile dopo la biopsia. Variazione nelle misurazioni di respirazione è bassa (tabella 1) a causa di un tempo breve trasporto dalla mucca al laboratorio. Per ridurre i tempi di trasporto, un piccolo laboratorio è stato istituito presso l'ufficio del caseificio, e campioni di fegato sono stati guidati al laboratorio ufficio come ciascuno è stato raccolto .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dai fondi Alltech e USDA Hatch attraverso il centro per la salute di cibo animale presso UC Davis School of Veterinary Medicine.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Biopsia epatica | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney strumento per biopsia epatica bovina | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Sutura | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Aghi da sutura | NA | NA | Inclusi con bisturi da sutura |
| Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # per manico e lame | |
| Asciugamani chirurgici | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Provette Falcon 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Pinzette | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| siringhe da 50 mL | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Aghi per iniezione (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| cavezza per mucche | Tractor Supply Co. | ||
| Cotton Swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| quadrati di garza di cotone (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Forbici mediche | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottiglia/mucca | Fornito da Veterinario | ||
| contro i clostridi | Fornito dal veterinario | ||
| Biopsia epatica antibiotici eccenel 2 cc/100 libbre per 3 giorni | Fornito dal veterinario | ||
| Providone Scrub | Aspen Risorse veterinarie | 21260221 | |
| Etanolo 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xilazina cloridrato 100 mg/mL EV a 0,010-0,015 mg/kg peso | Fornito dal veterinario | ||
| 2% lidocaina HCl (10-15 ml) | Fornito dal veterinario | ||
| 1 mg/kg di iniezione endovenosa di flunixina meglumina | Fornito dal veterinario | ||
| Isolamento dei mitocondri (fegato)< | |||
| strong>Equipment | |||
| Fiala di Wheaton da 30 mL con pestello in teflon con spazio di 0,16 mm | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Omogeneizzatore Motore | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Omogeneizzatore Sonda | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Pipetta automatica (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Becher (500 mL) con ghiaccio | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Microfuge refrigerato | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Provette per microfuge (1,5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinchoninico (BCA) (micropiastre per lettore di piastre) | abcam | ab102536 | |
| Saccarosio | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (senza acidi grassi) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitolo | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Acqua deionizzata | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Utilizzare per creare terreni di isolamento dei mitocondri: 220 mM di mannitolo, 70 mM di saccarosio, 20 mM di HEPES, 20 mM di Tris-HCl, 1 mM di EDTA e 0,1% (p/v) di BSA privo di acidi grassi, pH 7,4 a 4 gradi; C, durerà 2 giorni in frigorifero | |||
| Consumo di ossigeno mitocondriale | |||
| Attrezzatura | |||
| Oxygraph Setup + Elettrodo di ossigeno tipo Clark | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| ADInstruments | MLE2001 | ||
| Elettrodo di ossigeno tipo Clark | NA | ||
| NA Autopipetta (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Incluso con Oxy1 |
| Piccola ancoretta magnetica Fisher | Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipetta (10 μ L) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pHmetro | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Utilizzare per produrre terreni di consumo di ossigeno mitocondriale: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA, pH 7,4 a 30 gradi; C con 0,3% sgrassato BSA | |||
| Rotenone (soluzione da 4 mM) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinato (soluzione da 1 M) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (soluzione da 100 mM) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomicina (soluzione da 8 μ g/mL in etanolo) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Potenziale di membrana mitocondriale e forza motrice del protone | |||
| Equipment | |||
| TPMP elettrodo | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| non devono essere fresche, ma devono essere conservate in congelatore tra una tiratura e l'altra | |||
| Malonato (soluzione 0,1 mM) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomicina (8 μ g/mL in etanolo), conservare in congelatore | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in etanolo), conservare in congelatore | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP soluzione: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA, pH 7,4 a 30 gradi; C con BSA |
Riferimenti
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica ....
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Ristampe e permessi
