Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina

Summary

Vi presentiamo protocolli qui per isolamento ad alto rendimento di tilacoidi fisiologicamente attivo e analisi di trasporto di proteina per la traslocazione di cloroplasto doppia arginina (cpTat), secretiva (cpSec1) e vie di segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP).

Abstract

Cloroplasti sono gli organelli in piante verdi responsabile per lo svolgimento di numerose vie metaboliche essenziali, in particolare la fotosintesi. Entro i cloroplasti, il sistema a membrana tilacoide ospita tutti i pigmenti fotosintetici, complessi del centro di reazione e la maggior parte degli elementi portanti dell'elettrone ed è responsabile della sintesi di ATP di luce-dipendente. Oltre il 90% delle proteine del cloroplasto sono codificate nel nucleo, tradotta nel citosol e successivamente importati nel cloroplasto. Ulteriore trasporto di proteine in o attraverso la membrana tilacoide utilizza uno dei quattro percorsi di spostamento. Qui, descriviamo un metodo ad alto rendimento per l'isolamento di trasporto-competente tilacoidi dai piselli (Pisum sativum), insieme a saggi di trasporto attraverso le tre energia-dipendente cpTat, cpSec1 e cpSRP-ha mediato le vie. Questi metodi consentono sperimentazioni relative alla localizzazione della proteina tilacoide, trasporto energetica e i meccanismi di traslocazione di proteine attraverso le membrane biologiche.

Introduction

Quasi tutti i macchinari PROTEINICO responsabili cloroplasto corretta funzione deve essere spostati dal cytosol¹. Presso le buste del cloroplasto, substrati della proteina sono importati attraverso il Traslocone della membrana esterna (TOC) e il Traslocone della membrana interna (TIC)². Ulteriormente il targeting per il thylakoid membrana e lume si verifica attraverso la doppia arginina traslocazione (cpTat)³, il secretiva (cpSec1)⁴, il segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP)⁵e i percorsi di inserimento spontaneo⁶ . Un....

Protocol

1. materiali iniziale

1. Ammollo circa 55 g di piselli per 3 ore in 400 mL di acqua distillata e quindi seminare in un vassoio di plastica (35 x 20 cm x 6 cm) in terreno coperto con sottile strato di vermiculite.
2. Crescere il vassoio di piselli a 20 ° C sotto ciclo luce/buio (50 µE/m²s) 12/12 h per 9-15 giorni.
3. Preparare il substrato proteico secondo un metodo preferito.
   Nota: Abbiamo preparato substrati della proteina usando una varietà di metodi, tra cui 1) trascrizione in vitro da plasmidi purificati seguita da traduzione utilizzando estratti di germe di grano o di lisati di reticolociti di coniglio in presenza [

Results

Per misurare la quantità di substrato correttamente trasportato, è utile includere una o più corsie di "ingresso per cento". Per i dati presentati di seguito, è stato utilizzato il 10% della reazione trasporto finale senza tilacoidi. Questo ingresso"percentuale" aiuta anche a visualizzare le dimensioni del substrato precursore. La percentuale rappresenta una quantità del substrato con cui al substrato confronta trasportato contro nota, definita e possa essere regolata su o giù come necess.......

Discussion

Cloroplasto e tilacoidale isolamento

La rottura eccessiva può causare nel cloroplasto povero isolamento e così povero thylakoid resa dopo la separazione della sfumatura. È meglio omogeneizzare il tessuto raccolto delicatamente facendo in modo che tutto il materiale è sommerso prima di miscelazione e pulsare in 15 cicli di s fino a quando completamente omogeneizzato. Se necessario, utilizzare più cicli più brevi di miscelazione con meno tessuto in ogni round.

Tutti i ma.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pisum sativum seeds	Seedway LLC, Hall, NY	8686 - Little Marvel
Miracloth	Calbiochem, Gibbstown, NJ	475855-1
80% Acetone	Sigma, Saint Louis, MO	67-64-1
Frullatore con lame affilate	Waring Commercial	BB155S
Polytron 10-35	Fischer Sci	13-874-617
Percoll	Sigma, Saint Louis, MO	GE17-0891-01
Beckman J2-MC con rotore JA 20	Beckman-Coulter	8043-30-1180
Sorvall RC-5B con rotore HB-4	Sorvall	8327-30-1016
100 mM ditiotreitolo (DTT) in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	12/3/83	Può essere congelato in aliquote per uso futuro
200 mM MgATP in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	74804-12-9	Può essere congelato in aliquote per un uso futuro
Termolisina in 1xIB (2mg/mL)	Sigma, Saint Louis, MO	9073-78-3	Può essere congelato in aliquote per un uso futuro
HEPES	Sigma, Saint Louis, MO	H3375
K-Tricine	Sigma, Saint Louis, MO	T0377
Sorbitolo	Sigma, Saint Louis, MO	50-70-4
Cloruro di magnesio	Sigma, Saint Louis, MO	7791-18-6
Cloruro di manganese	Sigma, Saint Louis, MO	13446-34-9
EDTA	Sigma, Saint Louis, MO	60-00-4
BSA	Sigma, Saint Louis, MO	9048-46-8
Tris	Sigma, Saint Louis, MO	77-86-1
SDS	Sigma, Saint Louis, MO	151-21-3
Glicerolo	Sigma, Saint Louis, MO	56-81-5
Blu di bromofenolo	Sigma, Saint Louis, MO	115-39-9
B-Mercaptoetanolo	Sigma, Saint Louis, MO	60-24-2