पहचान, ऊतकवैज्ञानिक लक्षण वर्णन, और के लिए माउस प्रोस्टेट पालियों के विच्छेदन इन विट्रो 3d अंडाकार आकृति संस्कृति मॉडल
Summary
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों प्रोस्टेट कैंसर तंत्र की जांच के लिए उपयोगी मॉडल हैं । यहां हम एक माउस मूत्रजननांगी प्रणाली से पहचान और काटना प्रोस्टेट पालियों प्रोटोकॉल वर्तमान, उंहें प्रोटोकॉल के आधार पर अंतर है, और अलग और संस्कृति बहाव विश्लेषण के लिए spheroids के रूप में इन विट्रो में प्राथमिक प्रोस्टेट कोशिकाओं ।
Abstract
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) प्रोस्टेट कैंसर सहित मानव कैंसर के अधिकांश प्रकार की जांच के लिए प्रभावी पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में सेवा (पीसीए) । शरीर रचना विज्ञान और माउस प्रोस्टेट के प्रोटोकॉल को समझना कुशल उपयोग और ऐसे पशु मॉडलों के उचित लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है । माउस प्रोस्टेट पालियों के चार अलग जोड़े, अपनी विशेषताओं के साथ प्रत्येक है । यह लेख विच्छेदन और रोग विश्लेषण के लिए माउस प्रोस्टेट पालियों की पहचान की उचित विधि को दर्शाता है । पोस्ट-विच्छेदन, प्रोस्टेट कोशिकाओं को आगे यंत्रवत समझने के लिए इन विट्रो में कल्चरित किया जा सकता है । के बाद से माउस प्रोस्टेट प्राथमिक कोशिकाओं को अपने सामांय विशेषताओं जब इन विट्रो मेंसंस्कृति खो देते हैं, हम यहां कोशिकाओं को अलग करने और उंहें 3 डी अंडाकार आकृति संस्कृतियों, जो शारीरिक संरक्षण के लिए प्रभावी है के रूप में बढ़ के लिए एक विधि रूपरेखा कोशिकाओं के लक्षण । इन 3 डी संस्कृतियों कक्ष आकृति विज्ञान और निकट शारीरिक स्थितियों में व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बदल स्तर और प्रमुख प्रोटीन और एक रोग के विकास और प्रगति में शामिल रास्ते के स्थानीयकरण की जांच, और देख दवा उपचार के लिए प्रतिक्रियाएं ।
Introduction
वैज्ञानिक समुदाय के लिए दशकों से मानव कैंसर विकास के जटिल तंत्र को स्पष्ट का प्रयास किया गया है. संभावित प्रमुख खिलाड़ियों और दवा ठिकानों की पहचान जबकि रोगी कोशिकाओं और ऊतक अध्ययन के साथ शुरू होता है, इस तरह के निष्कर्षों के शोधों आवेदन अक्सर पूर्व नैदानिक पशु मॉडल के उपयोग की आवश्यकता है. आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों मॉडल (GEMMs) का उपयोग मॉडल मानव कैंसर के लिए तेजी से मानव कैंसर कंसोर्टियम (NCI-MMHCC), एक समिति है जो वर्णन और एकजुट माउस कैंसर की विशेषताओं की मांग की माउस मॉडल की स्थापना के बाद से बढ़ी है वैज्ञानिकों के लिए दुनिया भर में1,2मॉडल । माउस मॉडल पूर्व में यंत्रवत अध्ययन के लिए की जरूरत को पूरा कैंसर के अधिकांश प्रकार के नैदानिक अध्ययन, विकास को समझने के लिए, प्रगति, उपचार के लिए प्रतिक्रिया, और3प्रतिरोध प्राप्त की ।
प्रोस्टेट कैंसर पुरुषों में सबसे अधिक होने वाली कैंसर है, १६०,००० पुरुषों पर हर साल4प्रभावित । रोग के आक्रामक रूपों हर साल जीवन के हजारों के दसियों का दावा है । हालांकि, बीमारी बढ़ने की व्यवस्था अभी भी खराब समझ में आ रही है । उंनत और मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर के लिए प्रभावी उपचार के विकल्प की एक गंभीर कमी में यह परिणाम, के रूप में उंनत प्रोस्टेट कैंसर रोगियों में उच्च मृत्यु दर का सबूत4। इसलिए, प्रोस्टेट कैंसर का अध्ययन करने के लिए पूर्व नैदानिक मॉडलों के लिए एक बढ़ती जरूरत है । हालांकि, माउस और मानव प्रोस्टेट के बीच अंतर्निहित मतभेदों के कारण, GEMMs में प्रोस्टेट कैंसर की मॉडलिंग जब तक बार हार्बर वर्गीकरण प्रणाली २००४, जो माउस में histopathological परिवर्तन रेखांकित में पेश किया गया था लोकप्रियता हासिल नहीं किया आनुवंशिक हेरफेर पर प्रोस्टेट, नवोत्पादित परिवर्तन की पहचान, और5मनुष्यों में कैंसर की प्रगति के चरणों के लिए उनके संबंध । एक महत्वपूर्ण विशेषता माउस प्रोस्टेट है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए, जबकि किसी भी प्रोस्टेट GEMM मॉडल का अध्ययन पालियों के चार अलग जोड़े की उपस्थिति है: पूर्वकाल, पार्श्व, ventral और पृष्ठीय । पालियों histopathology और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न6में महत्वपूर्ण अंतर उपस्थित । बेसिन प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न युवा के बाद यौवन चूहों7, जो Cre आधारित GEMM मॉडल के बाद से विचार किया जाना चाहिए में पालियों के बीच भिंन हो सकते है ज्यादातर एक बेसिन आधारित मोटर पीबी बुलाया-Cre47का उपयोग कर डिजाइन किए हैं । परिणामस्वरूप स्थानिक और लौकिक मतभेद Cre अभिव्यक्ति में अक्सर ट्यूमर दीक्षा और प्रगति समयरेखा में मतभेद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पालियों के बीच नवोत्पादित परिवर्तन में अंतर करने के लिए नेतृत्व । इसलिए, प्रोस्टेट GEMMs में ट्यूमर के विकास का अध्ययन करते समय इस तरह के मतभेदों के लिए खाते के लिए महत्वपूर्ण है, और व्यक्तिगत पालियों reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए अलग से मूल्यांकन किया जा करने की आवश्यकता हो सकती है. इस लेख के पहले भाग के लिए एक माउस प्रोस्टेट काटना उचित तरीकों का वर्णन, पहचान और प्रत्येक पालि अलग, और पालियों के बीच ऊतकवैज्ञानिक मतभेदों को पहचाना ।
जबकि ट्यूमर के विकास और histopathology के विश्लेषण ट्यूमर के विकास में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, वे आणविक तंत्र के बारे में ज्यादा जानकारी प्रदान नहीं करते । ट्यूमर के विकास और प्रगति के तंत्र का अध्ययन करने के लिए, यह अक्सर इन विट्रो मेंट्यूमर कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है । कई तरीकों का सुझाव दिया गया है कि पिछले कुछ वर्षों में इन कोशिकाओं की संस्कृतियों शामिल, निलंबन संस्कृतियों, 3 डी संस्कृतियों8 और हाल ही में, नियमित रूप से 2d संस्कृतियों9। जबकि इन तरीकों में से सबसे अच्छा सेल अस्तित्व और प्रसार दर में परिणाम, 3 डी संस्कृतियों एक वातावरण है कि शारीरिक स्थितियों के करीब है प्रदान करते हैं । 3 डी या अंडाकार आकृति एक तहखाने झिल्ली extracellular मैट्रिक्स (ECM) में उगाया संस्कृतियों में, पूरी तरह से विभेदित चमकदार कोशिकाओं को आम तौर पर बहुत कम जीवित रहने की दर है; हालांकि, बेसल और मध्यवर्ती कोशिकाओं (ज्यादातर स्टेम सेल) के लिए प्रचार और सेल spheroids10बुलाया समूहों का उत्पादन कर रहे हैं । यह एक कैंसर के अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाता है के बाद से उपकला कैंसर स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न करने के लिए माना जाता है (लोकप्रिय कैंसर स्टेम सेल के रूप में जाना)11. इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में 3 डी संस्कृतियों में माउस प्रोस्टेट कोशिकाओं संवर्धन के लिए एक विधि का वर्णन । परिणामस्वरूप क्षेत्रों के बहाव का विश्लेषण के कई प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लाइव सेल इमेजिंग द्वारा organoid आकृति विज्ञान और व्यवहार के अध्ययन सहित, अलग प्रोटीन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, और कीमोथेरेपी के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन उपचार.
कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है प्रोस्टेट कैंसर में माउस मॉडल का उपयोग करने के लिए इष्टतम तरीकों की रूपरेखा को शरीर रचना विज्ञान और माउस प्रोस्टेट के विच्छेदन तकनीकों और अंडाकार आकृति संस्कृतियों और इन विट्रो विश्लेषण के लिए ऊतक के प्रसंस्करण का वर्णन .
Protocol
Representative Results
Discussion
यह कागज माउस प्रोस्टेट और व्यक्तिगत पालियों की पहचान के विच्छेदन के लिए तरीकों की रूपरेखा । यह भी वर्णित के लिए एक 3 डी संस्कृति में संवर्धन माउस प्रोस्टेट कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल है इन विट्रो वि?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, R01CA161018 से लालकृष्ण से अनुदान का समर्थन किया था ।
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
Riferimenti
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