식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부
Summary
유전자 조작된 생쥐 전립선 암 메커니즘을 조사를 위해 유용한 모델이 있습니다. 여기를 식별 하 고 마우스 비뇨 생식 기 시스템에서 전립선 엽 해 부, 조직학에 따라 구분 하 고 분리 다운스트림 분석에 대 한 spheroids로 기본 전립선 세포에는 생체 외에서 문화 프로토콜 선물이.
Abstract
유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs) 인간의 암, 전립선 암 (PCa) 등의 대부분의 종류를 조사에 대 한 효과적인 전 임상 모델 역할을 합니다. 해부학 및 조직학 마우스 전립선의 이해 하는 것이 효율적인 사용과 같은 동물 모델의 적절 한 특성에 대 한 중요 합니다. 마우스 전립선 엽 각각 그들의 자신의 특성의 4 가지 쌍 있다. 이 문서에서는 적절 한 해 부 방법 및 질병 분석에 대 한 마우스 전립선 엽의 식별 합니다. 후 해 부, 전립선 세포 배양 체 외에 기계적 이해에 대 한 추가 될 수 있습니다. 마우스부터 전립선 1 차 셀 그들의 일반적인 특성을 잃게 하는 경향이 때 교양 생체 외에서우리는 개요 여기 세포를 분리 하 고는 생리 보존에 대 한 효과 3D 회전 타원 체 문화로 그들을 성장 하는 방법 셀의 특성입니다. 이러한 3D 문화 세포 형태학 및 조사 근처 생리 적 조건에서 동작 변경 수준 및 주요 단백질 및 경로 개발에 참여의 지 방화는 질병의 진행을 분석 및 보고에 사용할 수 있습니다. 약물 치료에 응답 합니다.
Introduction
사회 과학 수십 년 동안 인간의 암 개발의 복잡 한 메커니즘을 명료 하 게 시도 되었습니다. 반면 잠재적인 핵심 선수 및 마약 대상 환자 세포와 조직 연구 시작, 종종 이러한 결과의 변환 응용 프로그램 전 임상 동물 모델의 사용을 해야 합니다. 유전자 조작된 생쥐 모델 (GEMMs) 모델 인간의 암 마우스 모델의 인간 암 컨소시엄 (NCI-MMHCC), 설명 및 마우스 암의 특성을 통합 하는 위원회의 설립 이후 꾸준히 상승 했다의 사용 과학자 들은 전세계1,2에 대 한 모델. 마우스 모델 개발, 진행, 치료에 응답을 이해 하기 위한 암 대부분의 종류의 전 임상 연구에서 기계 론 적인 연구에 대 한 필요성을 충족 하 고 저항3인수.
전립선 암은 남성, 모든4이상 160000 남자에 영향을 미치는 가장 일반적으로 발생 한 암이 이다. 적극적인 형태의 질병 생활 매년 수천 수만의 주장. 그러나, 질병의 진행의 메커니즘은 여전히 가난 하 게 이해 된다. 고급 전립선 암 환자4에서 높은 사망 율 알 수 있듯 고급 및 전이성 전립선 암에 대 한 효과적인 치료 옵션의 심각한 부족을 발생합니다. 따라서, 전립선 암 연구를 전 임상 모델에 대 한 필요성이 있다. 그러나, 마우스 및 인간의 전립선 사이의 고유의 차이 때문 GEMMs에 전립선 암의 모델링 얻지 않았다 인기 바 하버 분류 시스템 마우스 histopathological 변화를 설명 하는 2004 년에 도입 되었다 때까지 유전자 조작, 종양 약 변경, 식별 및 인간5암 진행의 단계에 그들의 관계의 전립선 어떤 전립선 GEMM 모델을 공부 하는 동안 고려 사항으로 수행 해야 하는 마우스 전립선의 하나의 중요 한 특징은 네 가지 쌍 돌출부의 존재: 전방, 측면, 복 부와 등 쪽. 돌출부는 histopathology 및 유전자 표현 패턴6에 큰 차이가 존재. Probasin 단백질 식 패턴 젊은 포스트 사춘기 마우스7, 고려 되어야 한다 Cre 기반 GEMM 모델은 주로 설계 되었습니다 이후 Pb-Cre47라고 probasin 기반 promotor를 사용 하 여에 돌출부 사이의 달라질 수 있습니다. 종종 Cre 식에서 결과 공간 및 시간 차이 이어질 종양 약 변화에 차이 뿐 아니라 종양 개시 및 진행 타임 라인에 차이 돌출부 사이. 따라서, GEMMs, 전립선에서 종양 개발을 공부 하는 동안 이러한 차이 담당 하는 것이 중요 하다 고 개별 돌출부 재현 가능한 결과 달성 하기 위해 평가 될 필요가 있습니다. 이 문서의 첫 번째 부분에는 마우스 전립선의 해 부, 식별 하 고 각 엽, 별도 돌출부 사이 조직학 차이 인식 적절 한 방법을 설명 합니다.
종양의 성장 및 histopathology 분석 종양 개발에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 그들은 분자 메커니즘에 대 한 많은 정보를 제공 하지 않습니다. 공부 하 고 종양의 개발 및 진행의 메커니즘, 그것은 종양 세포 생체 외분석 종종 유용 합니다. 서 스 펜 션 문화, 3D 문화8 을 포함 하 여 이러한 셀의 문화를 포함 하는 수 년에 걸쳐 여러 가지 방법이 제안 되었습니다 그리고 최근에, 일반 2D 문화9. 반면 이러한 메서드의 대부분 좋은 세포 생존 및 확산 속도 결과, 3D 문화 생리 적 조건에 가장 가까운 환경을 제공 합니다. 3D 또는 회전 타원 체 문화는 지하실 막 세포 외 기질 (ECM)에서 성장, 완전히 차별화 된 luminal 세포는 일반적으로 매우 낮은 생존 율을; 있다 그러나, 기초 및 중간 세포 (주로 줄기 세포) 라는 spheroids10셀 클러스터를 생산 하 고 전파 수 있습니다. 이것은 그것 암 연구에 대 한 적합 한 이후 상피 암 줄기 세포 (암 줄기 세포로 널리 알려져 있는)11에서 발생 한 것으로 추정 된다. 이 프로토콜의 두 번째 부분 3D 문화에 마우스 전립선 세포를 배양 하는 방법을 설명 합니다. 결과 분야 organoid 형태학 및 라이브 셀 이미징, 면역 형광 검사 다른 단백질에 대 한 얼룩으로 행동의 연구 및 화학요법에 대 한 응답의 연구를 포함 하 여 다운스트림 분석의 여러 종류에 사용할 수 있습니다. 치료입니다.
전반적으로,이 프로토콜의 목표는 마우스 전립선의 해부학 및 해 부 기술 및 회전 타원 체 문화 및 생체 외에서 분석을 위한 조직 처리를 설명 하 여 전립선 암에서 마우스 모델을 사용 하기 위한 최적의 방법 개요 .
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서는 마우스 전립선의 해 부 및 개별 돌출부의 식별 방법을 설명합니다. 또한 생체 외에서 분석에 대 한 3 차원 문화에 마우스 전립선 세포 배양에 대 한 프로토콜이입니다.
해 부 프로토콜의 중요 한 단계가입니다 (1) 마우스에서 전체 UGS를 수확 하 고 분리 해 부 현미경 아래 개별 기관. 전립선 조직 이며 매우 작은 UGS;의 나머지 부분에 의해 둘러싸인 따라서, 그것?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 암 연구소, LK에 R01CA161018에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
Riferimenti
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