Lentiviral vektor-medieret genterapi af hepatocytter Ex Vivo til autolog Transplantation hos svin
Summary
Denne protokol er beregnet til at beskrive svin hepatocyt isolation og ex vivo gen levering for at helbrede modeller af metaboliske sygdomme via autologe celler transplantation. Selv om netop denne model har unikke fordele, der favoriserer succesfulde terapi, er ansøgningen en relevant foundation til at løse flere sygdomme og indikationer.
Abstract
Genterapi er et ideelt valg til at helbrede mange medfødt fejl i metabolisme i leveren. Ex-vivo, lentiviral vektorer har været anvendt med succes til behandling af mange hæmatopoietisk sygdomme hos mennesker, som deres brug tilbyder stabil transgen udtryk på grund af den vektor evne til at integrere i vært genom. Denne metode viser anvendelsen af ex vivo genterapi af hepatocytter til en stor dyremodel af arvelige tyrosinemia type jeg. Denne proces består af 1) isolering af primære hepatocytter fra autolog giver/modtager dyr, 2) ex vivo gen levering via hepatocyt transduktion med lentiviral vektor og 3) autolog transplantation af korrigeret hepatocytter via portalen vene injektion. Succes af metoden generelt er afhængig af effektiv og sterile fjernelse af den lever resektion, omhyggelig håndtering af skåret modellen til isolation af levedygtige hepatocytter tilstrækkeligt til re engrafting, high-procentdel transduktion af isolerede celler, og aseptisk kirurgiske procedurer i hele til at forhindre infektion. Tekniske fejl i nogen af disse trin vil resultere i lavt udbytte af levedygtige transduced hepatocytter til autolog transplantation eller infektion af donor/recipient dyret. Gris model af menneskelige type 1 arvelige tyrosinemia (HT-1) valgt for denne tilgang er entydigt imødekommenhed over for sådan en metode, som selv en lille procentdel af engraftment korrigeret celler vil føre til genindsættelse af leveren med raske celler baseret på en kraftfuld selektiv fordel over oprindelige-syge hepatocytter. Selv om denne vækst udvalg ikke vil være sandt for alle indikationer, denne fremgangsmåde er et fundament for udvidelse til andre indikationer og giver mulighed for manipulation af dette miljø til at løse flere sygdomme, både inden for leveren og ud, mens kontrollere for eksponering for viral vektor og mulighed for off-target toksicitet og tumorigenisitetsforsøg.
Introduction
Medfødt fejl i metabolisme i leveren er en familie af genetiske sygdomme, der tilsammen påvirker så mange som 1 i 800 levendefødte1. Mange af disse sygdomme er enkelt gen defekter2 og funktionelt kan helbredes ved at indføre en enkelt korrigeret kopi af de berørte gen i et tilstrækkeligt antal hepatocytter3. Den faktiske procentdel af hepatocytter, der rettes varierer afhængigt af sygdom4 og er i høj grad afhængig af arten af det protein det koder, for eksempel, udskilte proteiner versus cytoplasmatisk. I de fleste tilfælde, er effekten af en behandling for metabolisk sygdom let analyseres gennem tilstedeværelsen af biomarkører ofte tilgængelige i omløb.
HT-1 er en medfødt fejl i metabolisme i leveren, der skyldes en defekt i fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, den sidste enzymatisk trin i tyrosin stofskifte6. FAH mangel fører til at bygge af toksiske metabolitter i leveren, der kan forårsage akut leversvigt og død eller i den kroniske form af sygdommen kan forårsage skrumpelever og hepatocellulært carcinom. Sygdommen ledes klinisk af administration af 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), et lille molekyle hæmmer af et enzym opstrøms af FAH i tyrosin stofskifte. Sygdommen giver et ideelt miljø til at teste gen terapi metoder, som vellykket korrektion af selv en lille antal hepatocytter vil i sidste ende resultere i genindsættelse af hele leveren med korrigerede celler i både små og store dyremodeller 7 , 8. dette sker fordi korrigeret celler har en dyb overlevelsesfordel over ukorrigeret celler på grund af ophobning af giftige metabolitter i sidstnævnte. Tabet af ukorrigeret hepatocytter giver mulighed for selektiv udvidelse af korrigeret hepatocytter konsekvent med den regenerative kapacitet af leveren. Behandling kan let følges ved at måle fald i cirkulerende tyrosin og succinylacetone niveauer efter transplantation.
For at retfærdiggøre den invasive art af den procedure, der omfatter en delvis hepatectomy, skal målet med denne fremgangsmåde være en varig helbredelse. Replikering inkompetente lentiviral vektorer bruges derfor, fordi de bliver stabilt integrere i hepatocyt genom9. at sikre levering af de korrigerede gen til alle datterceller som leveren vokser og udvides for at erstatte den hurtige tab af ukorrigeret celler. Dette er en fordel over adeno forbundet viral (AAV) vektorer, der primært findes som episomes, der kan kun overføres til en enkelt celle, datter under mitosen10 derved miste nogen effekt af behandling i løbet af få uger.
Selv om en voksende mængde af litteratur støtter sikkerheden for lentivirus11, bekymringer er genotoksiske begivenheder dæmpet ved at begrænse transduktion af værtsceller til en kontrolleret in vitro- miljø. Gratis vector er aldrig systemisk introduceret til værten, når denne metode udføres, begrænse de hepatocytter, der vil blive genindsat med autolog transplantation via portalen vene.
Denne rapport beskriver den metode i den kirurgiske og ex vivo procedurer bruges til at isolere hepatocytter for gen terapi ex vivo og efterfølgende autolog transplantation12 til behandling af HT-1 gris8. Den fulde proces omfatter 1) en delvis hepatectomy, der fungerer som en kilde til hepatocytter og en vækst stimulus for værtens leveren, 2) isolering af hepatocytter fra skåret leveren efterfulgt af ex vivo gen korrektion, og endelig 3) genindførelse af den korrigeret hepatocytter tilbage til værten. Den beskrevne metode er gældende for alle store dyremodeller med nogle ændringer, men kun FAH-mangelfuld gris13 vil have fordel af den selektive miljø for korrigeret hepatocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne rapport beskriver en ex vivo autolog gen terapi tilgang for at helbrede en svin model af HT-1. Det indebærer en delvis hepatectomy, efterfulgt af ex vivo hepatocyt isolation og transduktion af isolerede hepatocytter med lenti virus regnskabsmæssige korrigerende transgenet. Korrigeret autolog hepatocytter er derefter transplanteres tilbage til FAH mangelfuld dyr gennem Vena8. Selv om metoden er gældende for alle store dyremodeller med nogle ændringer, har FAH-mangelfuld …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Duane Meixner for ekspertise i udfører portåren injektion, Steve Krage, Joanne Pederson og Lori Hillin for støtte under de kirurgiske procedurer. Dette arbejde blev støttet af children’s Hospital of Minnesota Foundation og regenerativ medicin Minnesota. R.D.H. var finansieret gennem en NIH K01 DK106056 award og en Mayo Clinic Center for regenerativ medicin karriere udvikling Award.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Riferimenti
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
