Lentiviral בתיווך וקטור ריפוי גנטי של Hepatocytes לשעבר Vivo עבור השתלת עצמיים של החזירים
Summary
פרוטוקול זה נועד לתאר hepatocyte חזירי בידוד ו- ex-vivo המסירה הגן כדי לרפא את הדגמים של מחלות מטבוליות באמצעות השתלת תאים עצמיים. אף על פי המודל הזה נהנה יתרונות ייחודיים לטובת טיפול מוצלח, היישום הוא בסיס רלוונטי להתייחס אינדיקציות ומחלות נוספות.
Abstract
ריפוי גנטי הוא הבחירה האידיאלית כדי לרפא הרבה שגיאות מולדות של חילוף החומרים של הכבד. לשעבר-vivo, וקטורים lentiviral השתמשו בהצלחה בטיפול של מחלות רבות hematopoietic בבני אדם, כמו השימוש שלהם מציע ביטוי transgene יציבה בשל היכולת של וקטור לשלב לתוך הגנום המארח. שיטה זו ממחישה את היישום של ex-vivo טיפול גנטי של hepatocytes למודל בעלי חיים גדולים מסוג tyrosinemia תורשתי אני. תהליך זה מורכב 1) בידוד של ראשי hepatocytes מן החיה תורם עצמיים/נמען, 2) ex-vivo המסירה הגן באמצעות התמרה חושית hepatocyte עם וקטור lentiviral, 3) עצמיים השתלת hepatocytes המתוקן באמצעות הפורטל הווריד הזרקה. ההצלחה של השיטה מתבססת בדרך כלל הסרת יעיל וסטרילי ההסרה בכבד, זהיר של הדגימה נכרת עבור בידוד של קיימא hepatocytes מספיק עבור התמרה חושית מחדש engrafting, אחוז גבוהה של תאים מבודדים, ו אספטי ניתוחים בכל כדי למנוע זיהום. תקלה טכנית באחד השלבים הבאים יביא תשואה נמוכה של קיימא transduced hepatocytes להשתלה עצמיים או זיהום של החיה תורם/נמען. הדגם חזיר של האדם סוג 1 תורשתי tyrosinemia (HT-1) עבור גישה זו היא נוטה באופן ייחודי, השיטה כפי אפילו אחוז קטן של engraftment של תאים המתוקן יוביל איכלוס של הכבד עם תאים בריאים המבוססת על רב עוצמה יתרון סלקטיבי hepatocytes מקורי-חולה. למרות בחירה צמיחה זו לא יהיה נכון לגבי כל הסימנים, גישה זו היא קרן להרחבת לתוך אינדיקציות אחרות, מאפשרת תמרון של סביבה זו כדי לטפל במחלות נוספות, שניהם בתוך הכבד, ומעבר, בעוד שליטה חשיפה וקטור ויראלי והזדמנות רעילות את המטרה, tumorigenicity.
Introduction
שגיאות מולדות של חילוף החומרים של הכבד הם משפחה של מחלות גנטיות המשפיעות באופן קולקטיבי רבים כמו לידות חי 1 ב 8001. רבים של מחלות אלו יכולים להירפא באופן פונקציונלי על ידי החדרת המתוקן עותק יחיד של הגן המושפעת לתוך מספר מספיק של hepatocytes3הינם פגמים גנטית יחיד2 . אחוז hepatocytes זה דורש תיקון בפועל משתנה לפי המחלה4 והיא תלויה במידה רבה על האופי של החלבון שזה מקודד, לדוגמה, חלבונים הנמצאות מופרש לעומת cytoplasmic. ברוב המקרים, היעילות של כל טיפול למחלה מטבולית לבדיקה בקלות באמצעות הנוכחות של סמנים לעיתים קרובות זמינים במחזור.
HT-1 הוא שגיאה מולדת של חילוף החומרים של הכבד, תוצאה של פגם fumarylacetoacetate ההידרולז (FAH)5, השלב האחרון אנזימטי של טירוזין חילוף החומרים6. FAH לקוי מוביל לבנות של מטבוליטים רעילים בכבד יכול לגרום אי ספיקת כבד חריפה ומוות או בצורה כרונית של המחלה יכולה לגרום שחמת של hepatocellular קרצינומה. המחלה קלינית מנוהלת על ידי הממשל של 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), מעכב מולקולה קטנה של אנזים במעלה הזרם של FAH בחילוף החומרים טירוזין. המחלה מספק סביבה אידיאלית בו לבדוק שיטות טיפול גנטי, כמו תיקון מוצלח של אפילו מספר קטן של hepatocytes יביא בסופו של דבר איכלוס של הכבד כולו עם תאים המתוקן במודלים של בעלי חיים קטנים וגדולים 7 , 8. מצב זה מתרחש מאחר לתקן תאים יש יתרון הישרדות עמוקה על תאים שלא תוקנו בשל הצטברות מטבוליטים רעילים בחודש האחרון. אובדן hepatocytes שלא תוקנו מאפשר הרחבת סלקטיבי hepatocytes המתוקן בקנה אחד עם יכולת ההתחדשות של הכבד. הטיפול ניתן בעקבות בקלות על ידי מדידת הירידה במחזור טירוזין ורמות succinylacetone בעקבות השתלת.
כדי להצדיק את העיקרון החודרני של ההליך, הכוללת של hepatectomy חלקית, המטרה של גישה זו להיות תרופה עמיד. לכן, משמשים וקטורים lentiviral חסרי יכולת השכפול כי הם ישתלבו stably לתוך הגנום hepatocyte9. להבטיח משלוח של הגן המתוקן על כל התאים הבת כמו הכבד גדל ומרחיב כדי להחליף את אובדן מהיר של תאים שלא תוקנו. זה יתרון על וקטורים (AAV) ויראלי adeno הקשורים, אשר קיימים בעיקר episomes כי רק ניתן להעביר לתא הבת יחיד במהלך מיטוזה10 ובכך מאבד כל השפעה של הטיפול תוך מספר שבועות.
אף גוף גדל והולך של ספרות תומך הבטיחות של lentivirus11, חששות מעל genotoxic אירועים הם חמאני להגביל את התמרה חושית של המארח לתאים סביבה מבוקרת במבחנה . וקטור בחינם הוא הציג לעולם מערכתית למחשב המארח, כאשר מבוצע בשיטה זו, הגבלת החשיפה hepatocytes זה יהיה יוצג מחדש עם השתלת עצמיים דרך וריד שער הכבד.
הדו ח מתאר את שיטת הניתוח ואת שמחוץ הליכים המשמשים כדי לבודד hepatocytes עבור ג’ין טיפול ex-vivo ו עוקבות עצמיים השתלת12 לטיפול של חזיר HT-18. התהליך המלא כולל 1) hepatectomy חלקית, המשמשת מקור hepatocytes ו גירוי לצמיחה עבור הכבד של המחשב המארח, 2) בידוד של hepatocytes מהכבד נכרת ואחריו שמחוץ ג’ין תיקון, ולבסוף 3) בעלי חיים לטבע של hepatocytes המתוקן בחזרה לתוך המחשב המארח. השיטה המתוארת החלים על כל הדגמים בעלי חיים גדולים עם כמה שינויים, אבל היתרון של הסביבה סלקטיבית עבור hepatocytes המתוקן יהיה רק FAH לקויה חזיר13 .
Protocol
Representative Results
Discussion
הדו ח מתאר שמחוץ ג’ין עצמיים טיפול בגישה לרפא מודל חזירי של HT-1. זה כרוך hepatectomy חלקית, ואחריו שמחוץ hepatocyte בידוד, התמרה חושית של hepatocytes מבודד עם וירוס lenti נושאת את transgene מתקנת. המתוקן hepatocytes עצמיים מושתלים ואז לחזור החיה לקוי FAH דרך וריד שער8. השיטה המתוארת אמנם החלים על כל ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים דוויין Meixner על מומחיות בביצוע את הזרקת וריד שער הכבד, סטיב Krage, ג’ואן פדרסון, לורי Hillin לתמיכה במהלך הניתוחים. עבודה זו נתמכה על ידי בית החולים של מינסוטה קרן של הילדים רפואה רגנרטיבית מינסוטה. R.D.H. מומן באמצעות פרס NIH K01 DK106056, מרכז מרפאת מאיו פרס פיתוח הקריירה רפואה רגנרטיבית.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Riferimenti
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
