Terapia del Gene mediada por vectores lentivirales de hepatocitos Ex Vivo para trasplante autólogo en cerdos
Summary
Este protocolo pretende describir hepatocitos porcinos aislamiento y ex vivo gene entrega modelos de enfermedades metabólicas mediante trasplante autólogo de células de la curación. Aunque este modelo en particular disfruta de ventajas únicas que favorecen el tratamiento exitoso, la aplicación es una base pertinente para atender las indicaciones y enfermedades adicionales.
Abstract
La terapia génica es una opción ideal para curar muchos de los errores innatos del metabolismo del hígado. Ex vivo, vectores lentivirales se han utilizado con éxito en el tratamiento de muchas enfermedades hematopoyéticas en humanos, ya que su uso ofrece la expresión del transgén estable debido a la capacidad del vector para integrarse en el genoma del anfitrión. Este método demuestra la aplicación de la terapia génica ex vivo de hepatocitos en un modelo animal grande de la Tirosinemia hereditaria tipo I. Este proceso consiste en 1) aislamiento de hepatocitos primarios del animal donante autólogo/receptor, 2) ex vivo entrega gene vía transducción de hepatocitos con vectores lentivirales y 3) autólogo trasplante de hepatocitos corregidos vía portal inyección de la vena. Éxito del método depende generalmente de la extracción eficiente y estéril de la resección hepática, cuidadosa manipulación del espécimen suprimido para el aislamiento de hepatocitos viables suficientes para volver a engrafting, alto porcentaje de transducción de las células aisladas, y procedimientos quirúrgicos asépticos en todas partes para prevenir la infección. Fallo técnico en cualquiera de estos pasos resultará en bajo rendimiento de hepatocitos transduced viables para trasplante autólogo o infección del animal donante/receptor. El modelo de cerdo de tipo humano 1 tyrosinemia hereditario (HT-1) para este enfoque es excepcionalmente favorable a dicho método, como incluso un pequeño porcentaje del engraftment de células corregidas llevará a repoblación del hígado con las células sanas, basadas en un potente ventaja selectiva sobre hepatocitos nativos enfermos. Aunque esta selección de crecimiento no será válida para todas las indicaciones, este enfoque es una base para la expansión en otras indicaciones y permite la manipulación de este medio para tratar las enfermedades adicionales, tanto en el hígado y más allá, mientras que control de exposición a vectores virales y oportunidad para toxicidad de objetivo y tumorigenicidad.
Introduction
Errores innatos del metabolismo del hígado son una familia de enfermedades genéticas que afectan colectivamente a tantos como 1 en 800 nacidos vivos1. Muchas de estas enfermedades son defectos de gen único2 y funcionalmente pueden curarse mediante la introducción de una única copia corregida del gen afectado en un número suficiente de hepatocitos3. El porcentaje real de hepatocitos que necesita ser corregida varía según la enfermedad4 y depende en gran medida la naturaleza de la proteína que codifica, por ejemplo, excretadas proteínas versus citoplásmico. En la mayoría de los casos, eficacia de cualquier tratamiento para enfermedad metabólica se analizan fácilmente a través de la presencia de biomarcadores a menudo disponibles en la circulación.
HT-1 es un error innato del metabolismo del hígado que resulta de un defecto de fumarylacetoacetate hidrolasa (FAH)5, el último paso enzimático en el metabolismo de tirosina6. Deficiencia de la FAH lleva a la acumulación de metabolitos tóxicos en el hígado que puede causar la muerte y la insuficiencia hepática aguda o en la forma crónica de la enfermedad puede causar cirrosis y el carcinoma hepatocelular. La enfermedad clínicamente está gestionada por la administración de 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), un inhibidor de molécula pequeña de enzima aguas arriba de la FAH en el metabolismo de la tirosina. La enfermedad ofrece un entorno ideal probar métodos de terapia génica, como corrección acertada de incluso un pequeño número de hepatocitos resultará eventualmente en la repoblación del hígado entero con células corregidas en modelos de animales grandes y pequeños 7 , 8. esto ocurre porque corrigió las células tienen una ventaja de supervivencia profunda sobre las células sin corregir debido a la acumulación de metabolitos tóxicos en el último. La pérdida de hepatocitos permite expansión selectiva de hepatocitos corregidos consistente con la capacidad regenerativa del hígado. Tratamiento puede seguirse fácilmente midiendo la disminución en la circulación de los niveles de tirosina y succinylacetone después del trasplante.
Para justificar la naturaleza invasiva del procedimiento, que incluye una hepatectomía parcial, el objetivo de este enfoque debe ser una cura duradera. Por lo tanto, vectores lentivirales incompetente de replicación se utilizan porque estable integrará en el genoma de hepatocitos9. garantizar la entrega del gene corregido a todas las células de la hija como el hígado crece y se expande para reemplazar la pérdida rápida de células sin corregir. Esto es ventajoso sobre vectores (AAV) virales adeno asociado, existen principalmente como episomas que sólo pueden pasar a una célula hija durante la mitosis10 perdiendo cualquier efecto de la terapia en cuestión de semanas.
Aunque un creciente cuerpo de literatura es compatible con la seguridad de los lentivirus11, preocupaciones sobre eventos genotóxicos son mitigados por la limitación de la transducción de las células del huésped en un ambiente controlado en vitro . Vector libre nunca sistémicamente se introduce en el host cuando se realiza este método, limitar la exposición a los hepatocitos que será reintroducido con trasplante autólogo vía la vena porta.
Este informe describe el método de la cirugía y ex vivo de procedimientos empleados para aislar hepatocitos para terapia génica ex vivo y posterior trasplante autólogo12 para el tratamiento de la de cerdo HT-18. El proceso completo incluye 1) una hepatectomía parcial que sirve como fuente de hepatocitos y un estímulo de crecimiento para el hígado del hospedador, 2) aislamiento de hepatocitos del hígado suprimido seguida por corrección de génica ex vivo y finalmente 3) reintroducción de la hepatocitos corregidos de nuevo en el host. El método descrito es aplicable a todos los modelos animales grandes con algunas modificaciones, pero sólo el cerdo de FAH deficiente13 tendrá la ventaja del medio selectivo de hepatocitos corregidas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este informe describe un gen autólogas ex vivo terapia enfoque para curar un modelo porcino de HT-1. Se trata de una hepatectomía parcial, seguida por ex vivo el aislamiento de hepatocitos y transducción de hepatocitos aislados con lenti virus lleva el transgén correctivo. Hepatocitos autólogos corregidas luego se trasplantan a los animales deficientes de FAH a través de la vena porta8. Aunque el método descrito es aplicable a todos los modelos animales grandes con alguna …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Duane Meixner por experiencia en la realización de la inyección en la vena portal, Steve Krage, Joanne Pederson y Lori Hillin de apoyo durante los procedimientos quirúrgicos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación del Hospital de Minnesota y medicina regenerativa Minnesota los niños. R.D.H. fue financiado a través de un premio de NIH K01 DK106056 y un centro de Mayo Clinic para el Premio de desarrollo de carrera de medicina regenerativa.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Riferimenti
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