वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया विश्लेषण रिवर्स प्रतिलेखन के साथ संयुक्त (RT-qPCR) व्यापक रूप से आरएनए वायरस संक्रमण के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहाँ हम एक प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख प्रस्तुत करते हैं, जिसमें डेंगू वायरस सहित कई आरएनए वायरस के ठहराव के लिए विकसित एक आरएनए शुद्धि चरण की आवश्यकता नहीं है ।
वर्तमान में, वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रौद्योगिकी अनुसंधान प्रयोगशालाओं में वायरल जीनोम का पता लगाने और ठहराव के लिए एक अनिवार्य उपकरण है, साथ ही आणविक निदान के लिए, अपनी संवेदनशीलता, विशिष्टता के कारण, और सुविधा. हालांकि, ज्यादातर मामलों में, मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) आमतौर पर वायरस के संक्रमण का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया परख वायरल न्यूक्लिक एसिड की शुद्धि के लिए पहले पीसीआर कदम पर भरोसा है । इस अध्ययन में, प्रतिदीप्ति आधारित रिवर्स प्रतिलेखन qPCR (RT-qPCR) परख एक प्रसंस्करण बफर और एक कदम आरटी-पीसीआर एजेंट के संयोजन के माध्यम से विकसित की है ताकि पूरी प्रक्रिया, संस्कृति supernatant के वायरस से संक्रमित की फसल से वास्तविक समय का पता लगाने जब तक कोशिकाओं, वायरल आरएनए शुद्धि के बिना प्रदर्शन किया जा सकता है । स्थापित प्रोटोकॉल ९० मिनट के भीतर डेंगू वायरस (देंव) की आरएनए सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के ठहराव सक्षम बनाता है । इसके अलावा, एक एंटीवायरल एजेंट के मूल्यांकन के लिए प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख के अनुकूलन क्षमता एक इन विट्रो प्रयोग में एक पहले रिपोर्ट देंव अवरोध करनेवाला, mycophenolic एसिड (MPA) का उपयोग करके प्रदर्शन किया है । इसके अलावा, अन्य आरएनए वायरस, जिनमें येलो फीवर वायरस (YFV), Chikungunya वायरस (CHIKV), और खसरा वायरस (MeV) शामिल हैं, को एक ही प्रोटोकॉल के साथ डायरेक्ट आरटी-quantified द्वारा qPCR किया जा सकता है । इसलिए, इस रिपोर्ट में वर्णित प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख एक सरल और तेजी से तरीके से आरएनए वायरस प्रतिकृति की निगरानी के लिए उपयोगी है, जो आगे एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग अध्ययन और नैदानिक निदान के लिए एक होनहार मंच में विकसित किया जाएगा ।
Flaviviridae परिवार की जीनस Flavivirus से अधिक ७० लिफाफे, सकारात्मक असहाय आरएनए वायरस है कि मच्छरों और ticks द्वारा फैलता है शामिल हैं । महत्वपूर्ण बात, मानव में flavivirus संक्रमण अक्सर गंभीर नैदानिक बीमारी की ओर जाता है, जैसे रक्तस्रावी बुखार और इन्सेफेलाइटिस1. दरअसल, Zika वायरस (ZIKV), एक flavivirus का हाल ही का प्रकोप, अमेरिका भर में विस्फोटक फैल गया है और microcephaly2,3सहित स्नायविक जटिलताओं के साथ जुड़े होने के लिए दिखाया गया है । Flaviviruses, इसलिए, आधुनिक समाज पर महत्वपूर्ण नैदानिक और आर्थिक प्रभाव है ।
एक महत्वपूर्ण flavivirus डेंगू वायरस (देंव), एक मच्छर जनित वायरस व्यापक रूप से दुनिया के उष्णकटिबंधीय और उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में वितरित किया जाता है । देंव एडीज मच्छरों द्वारा फैलता है, जिसमें एडीज albopictus और एडीज aegyptiशामिल होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डेंगू का प्रकोप4के वैश्विक प्रसार में होता है । वर्तमान में, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ने डेंगू रोग को तीन श्रेणियों के रूप में वर्गीकरण: डेंगू बिना चेतावनी के संकेत, चेतावनी के संकेत के साथ डेंगू, और गंभीर डेंगू4. हालांकि प्राथमिक संक्रमण देंव के चार serotypes में से एक के साथ (देंव-1 से-4) अक्सर स्पर्शोन्मुख या स्वयं सीमित है, epidemiologic अध्ययन से पता चला है कि अलग serotypes के माध्यमिक संक्रमण डेंगू के अधिक गंभीर रूपों का खतरा बढ़ जाता है । यह ध्यान देने योग्य है कि प्राथमिक संक्रमण के दौरान उत्पादित गैर या बेअसर एंटीबॉडी की वजह से देंव संक्रमण के एंटीबॉडी पर निर्भर वृद्धि, द्वितीयक संक्रमण के रूप में हुई है जो गंभीर डेंगू के एक संभावित तंत्र के रूप में प्रस्तावित किया गया है लायक है । हालांकि, कोई विशिष्ट एंटीवायरल दवा देंव संक्रमण5के लिए उपलब्ध है ।
देंव, दिनचर्या और मजबूत परख है, जो एक उच्च प्रवाह की स्थापना के लिए उत्तरदाई है के खिलाफ एंटीवायरल एजेंटों के विकास के लिए, वायरस प्रतिकृति मात्रात्मक का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं । पारंपरिक, जैविक परख (उदाहरणके लिए, पट्टिका परख) संक्रामक वायरस और प्रतिरक्षा परख (जैसे, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख [एलिसा]) वायरल एंटीजन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है देंव पर नजर रखने के लिए इन विट्रो में और vivo6,7में प्रतिकृति । हालांकि, इन परख अक्सर श्रमसाध्य है और कई दिनों को पूरा करने की आवश्यकता है, जो नमूनों की बड़ी संख्या की हैंडलिंग में बाधा उत्पंन । इस संबंध में, RT-qPCR देंव संक्रमण का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय परख है: यह विशिष्ट है, संवेदनशील, और अपेक्षाकृत तेजी से7. इसके अलावा, RT-qPCR तकनीक एक उच्च-प्रवाह स्वरूप में अधिक लाभ है । फिर भी, आरएनए वायरस के लिए आरटी-पीसीआर की विशिष्ट प्रक्रिया एकत्र नमूनों से वायरल न्यूक्लिक एसिड की वसूली की मांग करता है । हालांकि विभिंन निष्कर्षण तरीकों RT-qPCR के लिए नियोजित किया जा सकता है, कई कदम अभी भी शुद्ध वायरल आरएनए प्राप्त करने की जरूरत है । इसके अलावा, RT-qPCR परख आम तौर पर महंगी स्पिन कॉलम या खतरनाक कार्बनिक सॉल्वैंट्स की आवश्यकता होती है, जिससे तैयारी प्रक्रिया को अधिक बोझिल बना । के बाद से परहेज और/या पार के नमूनों के बीच संदूषण वायरल जीनोम के सफल ठहराव के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, एक कम श्रमसाध्य और समय लेने वाली विधि पसंद है, विशेष रूप से अगर आर टी-qPCR को लागू किया जाना है उच्च-प्रवाह स्वरूप ।
यहां, हम संक्रमित कोशिकाओं है कि वायरल आरएनए शुद्धि शामिल नहीं है की एक संस्कृति supernatant में देंव आरएनए को मापने के लिए एक सरल आरटी-qPCR प्रक्रिया की रिपोर्ट । इस अनुकूलित RT-qPCR प्रोटोकॉल दो चरणों से बना है: i) एक प्रसंस्करण बफर के साथ देंव-संक्रमित कोशिका संस्कृति की supernatant की मशीन, और द्वितीय) एक कदम आरटी एक वास्तविक समय पीसीआर साधन पर qPCR । तदनुसार, एक संस्कृति supernatant में देंव आरएनए ९० मिनट (चित्रा 1) के भीतर पता लगाया जा सकता है । हम भी अन्य आरएनए वायरस संक्रमण के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR के आवेदन का वर्णन ।
आज, फ्लोरोसेंट द्वारा वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के आधार पर वास्तविक समय पीसीआर रोगजनक मानव वायरस के आणविक निदान, अपनी संवेदनशीलता और तेजी से7के कारण के लिए एक सोने का मानक बनता जा रहा है । यह डेंगू बुखार17जैसे तीव्र संक्रामक रोगों के प्रारंभिक चरण में पुष्टि वायरस संक्रमण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, बुनियादी DNEV अनुसंधान, RT-qPCR परख के क्षेत्र में में वायरस प्रतिकृति निगरानी के लिए एक अनिवार्य उपकरण है इन विट्रो संस्कृति, जो देंव की प्रतिकृति जीव विज्ञान की समझ और एंटीवायरल अवरोधकों की खोज करने के लिए नेतृत्व करेंगे । इस अध्ययन में, फ्लोरोसेंट आधारित वास्तविक समय पीसीआर परख एक प्रसंस्करण बफर और एक कदम RT-पीसीआर एजेंट के संयोजन के द्वारा विकसित किया गया था ताकि संक्रमित कोशिकाओं के कल्चरल supernatant में देंव आरएनए को शुद्ध किए बिना rt-qPCR द्वारा quantified किया जा सके वायरल आरएनए जीनोम । जब नियमित परख की तुलना में इस तरह के पट्टिका परख, एलिसा, या पारंपरिक आरटी के रूप में वायरस प्रतिकृतिकरण का पता लगाने के लिए qPCR-आरएनए शुद्धीकरण6,7, आर टी-qPCR परख के एक सरलीकृत प्रोटोकॉल समय की एक महान कमी में परिणाम और देंव आरएनए के लिए आवश्यक कदम । यह भी एक महत्वपूर्ण विशेषता है कि संक्रमण और आनुवंशिक सामग्री की हानि को कम करने में लाभ है । फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक साफ डाकू का उपयोग IVT के सेट अप में आवश्यक है (चरण २.१) और आर टी-qPCR (कदम 4.1 – 4.4) प्रतिक्रियाओं के पार से बचने के लिए कोई amplicon-संबंधित उत्पादों या RNase के संदूषण । यह भी एक सुरक्षा कैबिनेट (कदम ३.३) प्रयोगशाला संक्रमण का खतरा कम करने के लिए अंदर संक्रामक वायरस, सहित संस्कृति supernatant, संभाल करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख का एक और महत्व है कि वायरल आरएनए प्रतियां की एक विस्तृत श्रृंखला कमजोर पड़ने या नमूने की एकाग्रता के बिना एक ही समय में विश्लेषण किया जा सकता है । जब एक प्रश्नपत्र पतला देंव 3 ‘ UTR आरएनए मानक का इस्तेमाल किया गया था, प्रत्यक्ष आरटी-qPCR प्रोटोकॉल परिमाण के सात आदेशों पर एक रैखिक मानक वक्र का उत्पादन, और कम ठहराव सीमा ५०० आरएनए प्रतियां (चित्रा 2) था । संक्रमित कोशिकाओं के कल्चरल supernatant में देंव का पता लगाने के लिए, 8 x 103 से 8 x 10-2 PFU वायरस एक 10 μL RT-qPCR में देंव 3 ‘ UTR आरएनए मानक की सीमा के भीतर थे, और कम पता लगाने की सीमा (8 x 10-2 PFU) 11 शामिल करने के लिए गणना की गई थी , ४०० ± ७,०७७ आरएनए प्रतियां (चित्र बी) । के रूप में कई flavivirus अध्ययन में रिपोर्ट18,19,20, वायरल आरएनए के बड़े अनुपात की प्रतियां वायरस संक्रामक titer (यानी, PFU) देंव नमूनों में भी इस अध्ययन में मनाया गया था । इस अनुमान को काफी हद तक दोषपूर्ण की उपस्थिति (यानी, गैर संक्रामक) वायरस या मुक्त वायरल संक्रमित और मृत कोशिकाओं से जारी आरएनए की वजह से माना जाता है । यद्यपि आरएनए के अनुपात की प्रतियां: इस अध्ययन में प्राप्त PFU (१.१ x 105 से १.३ x 105 आरएनए प्रतियां/PFU) पहले दिखाए गए डेटा के साथ असंगत था (अनुपात 1 से 3 लॉग से श्रेणी)21,20, यह हो सकता है वायरस उपभेदों, कोशिकाओं में अंतर के लिए जिंमेदार ठहराया, या संस्कृति शर्तों कार्यरत हैं । विसंगति के लिए एक और संभावना विवरण है कि, के बाद से कोई आरएनए शोधन प्रक्रिया प्रत्यक्ष आर टी में शामिल किया गया था qPCR परख वर्णित इस के साथ साथ, संस्कृति supernatant में अधिक देंव आरएनए के वायरल के नुकसान के बिना वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण से पता लगाया जा सकता है आनुवंशिक सामग्री ।
प्रत्यक्ष RT-qPCR की सादगी बहु-अच्छी तरह से प्रारूपों में नमूनों की एक बड़ी संख्या को संभालने की क्षमता को बढ़ाता है, इस तरह के रूप में एक ९६-अच्छी तरह से थाली. इसलिए, यह गुण एंटी-देंव दवाओं की खोज के लिए एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग अध्ययन करने के लिए प्रत्यक्ष RT-qPCR परख के भविष्य के आवेदन की सहायता करेगा । दरअसल, इस रिपोर्ट में, एक विरोधी के सत्यापन के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR परख के आवेदन-देंव अवरोध करनेवाला, MPA, जांच की थी, और परिणाम से पता चला कि MPA के एक आईसी५० मूल्य प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख (चित्रा 4) द्वारा प्राप्त की तुलना में था कि पट्टिका परख12,13का उपयोग कर पिछले अध्ययनों में रिपोर्ट । यह दर्शाता है कि प्रत्यक्ष आरटी-qPCR उचित एंटीवायरल एजेंटों के निरोधात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी परख है और भविष्य में एक दवा स्क्रीनिंग अध्ययन में अपनाया जा सकता है ।
इस अध्ययन में, अन्य आरएनए वायरस का पता लगाने के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR लागू करने के लिए प्रयास किए गए थे । के रूप में चित्रा 5में दिखाया गया है, जब तीन अंय आरएनए वायरस (YFV, CHIKV, और MeV) के 10 गुना कमजोर पड़ने अलग पीढ़ी में वर्गीकृत (Flaviviridae, Togaviridae, और Paramyxoviridae, क्रमशः) का उपयोग कर जांच की गई पहले से संबंधित वायरल आरएनए दृश्यों के लिए विशिष्ट प्राइमरों और fluorogenic जांच की सूचना दी । संक्रामक titers और सीटी मूल्यों के बीच अच्छा संबंध प्रत्यक्ष RT-qPCR परख द्वारा प्राप्त किए गए थे, और सहसंबंध परिमाण के 4-6 रैखिक आदेश थे । यह पता चलता है कि प्रत्यक्ष आरटी-qPCR प्रोटोकॉल बस वायरस विशिष्ट प्राइमरों और fluorogenic जांच बदल द्वारा विभिन्न प्रकार आरएनए वायरस के लिए अनुकूल है.
फिर भी, इस अध्ययन (चित्रा 5) में परीक्षण वायरस के बीच विभिन्न का पता लगाने की संवेदनशीलता. प्रोटोकॉल है कि लक्ष्य वायरस आरएनए का पता लगाने में सुधार कर सकते हैं में से एक संशोधन प्राइमर/जांच दृश्यों का एक नया सेट का उपयोग करने के लिए होना चाहिए । इसके अतिरिक्त, सफल प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के लिए नमूना प्रसंस्करण कदम के दौरान वायरल जीनोम के कुशल रिलीज होने लगा है (कदम 3.1 – 3.4) । इस तरह के एक गैर लिफाफा वायरस के रूप में स्थिर वायरस का मात्रात्मक पता लगाने के लिए विशेष महत्व का होगा । हालांकि एक प्रारंभिक प्रयोग के रूप में, Coxsackievirus B3 (CVB3), एक गैर-ढंक आरएनए वायरस Picornaviridaeसे संबंधित, प्रत्यक्ष RT-qPCR परख पहले वर्णित CVB3-विशिष्ट प्राइमरों और फ्लोरोसेंट जांच22का उपयोग कर के अधीन था, एक एक उच्च titer (1 x 105 PFU/mL) वायरस स्टॉक के साथ भी धनात्मक amplicon संकेत का पता नहीं लगाया जा सका । यह मोटे तौर पर गैर के उच्च शारीरिक अखंडता के लिए जिंमेदार माना जाता है-लिफाफा वायरस । अब तक, आरएनए रिलीज चरण23,24,25 में विभिन्न प्रोटोकॉल को रोजगार जो कई आरएनए वायरस का पता लगाने के लिए न्यूक्लिक एसिड की शुद्धि की आवश्यकता नहीं है कि कुछ आरटी पीसीआर परख विकसित किया गया है, 26. इस प्रकार, एक उच्च तापमान पर एक वायरस के नमूने की एक मशीन के रूप में वैकल्पिक (या अतिरिक्त) उपचार, का उपयोग, संभावित पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ जाती है ।
संक्षेप में, इस अध्ययन में विकसित प्रत्यक्ष आरटी-qPCR प्रोटोकॉल संक्रमित कोशिकाओं के एक संस्कृति supernatant में वायरल आरएनए को बढ़ाता है के लिए एक सरल और तेजी से लेकिन विश्वसनीय तरीका था । इस सादगी की वजह से, प्रत्यक्ष आर टी-qPCR परख एक कम समय है, जो वायरस प्रतिकृति के उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए वादा रखती में नमूनों की एक संख्या प्रक्रिया सकता है । इसके अलावा, अंय आरएनए वायरस के लिए प्रत्यक्ष आरटी-qPCR प्रोटोकॉल के आवेदन भी प्रदर्शन किया गया था । इस दृष्टिकोण, इसलिए, कुशलतापूर्वक एक अनुसंधान प्रयोगशाला की स्थापना में आरएनए वायरस संक्रमण की निगरानी के लिए एक उपयोगी उपकरण होना चाहिए और, संभवतः, नैदानिक निदान में.
The authors have nothing to disclose.
लेखक सुभाष जी वासुदेवन (ड्यूक-NUS ग्रेजुएट मेडिकल स्कूल, सिंगापुर) के लिए देंव-2 अलग EDEN2 ३२९५ और Shunro Imura (कोबे संगरोध स्टेशन, जापान) YFV पहले 17d वैक्सीन तनाव के लिए धंयवाद । लेखक अपनी सहायता के लिए माइक्रोबायोलॉजी विभाग और संक्रमण नियंत्रण के सदस्यों के भी आभारी हैं । इस काम को MEXT KAKENHI ग्रांट नंबर JP16737900 ने सपोर्ट किया है ।
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | > 600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |