Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)
Summary
Deze methode van trypanosoom afscheiding van bloed is afhankelijk van hun oppervlakte lading minder negatief dan bloed zoogdiercellen. Geïnfecteerd bloed is geplaatst en worden behandeld op een anionenwisselaar kolom. Deze methode, de meest passende diagnose voor slaapziekte, biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologie onderzoek.
Abstract
Met deze methode kunt de scheiding van trypanosomen, parasieten die verantwoordelijk is voor mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis (hoed), van besmet bloed. Dit is de beste methode voor diagnose van eerste fase hoed en bovendien deze parasiet reiniging methode toelaat serologische en onderzoek van onderzoeken.
HOED wordt veroorzaakt door de tseetseevlieg verzonden Trypanosoma brucei gambiense en T. b. rhodesiense. Verwante trypanosomen zijn de causatieve agenten van dierlijke trypanosomiasen. Opsporing van trypanosoom is essentieel voor de diagnose, de behandeling en de follow-up van de hoed. De hier beschreven techniek is de meest gevoelige parasiet detectie techniek, aangepast aan de veldomstandigheden voor de diagnose van T. b. gambiense hoed en binnen een uur kan worden voltooid. Bloed is gelaagd op een anionenwisselaar kolom (cellulose Gebondenkleurstof) eerder aangepast aan de pH 8, en elutie buffer wordt toegevoegd. Zeer negatief geladen bloedcellen zijn geadsorbeerde op de kolom, terwijl de minder negatief geladen trypanosomen passeren. Verzamelde trypanosomen zijn Ingehuld door centrifugeren en waargenomen door microscopie. Parasieten zijn bovendien bereid zonder cellulaire schade met behoud van hun infectiviteit.
Gezuiverde trypanosomen zijn vereist voor immunologische testen; ze worden gebruikt in de trypanolyse test, de gouden standaard in HAT serologie. Gekleurd parasieten worden gebruikt in de kaart agglutinatietest (CATT) voor veld serologie. Antigenen van gezuiverde trypanosomen, zoals variant oppervlakte glycoproteïne, exoantigens, worden ook gebruikt in verschillende immunoassay. De hier beschreven procedure is ontworpen voor Afrikaanse trypanosomen; chromatografie voorwaarden hebben bijgevolg elk trypanosoom-stam, en meer in het algemeen, worden aangepast aan het bloed van elke soort host zoogdier.
Deze fascinerende ziekteverwekkers zijn gemakkelijk gezuiverde en beschikbaar voor gebruik biochemische, moleculaire en cel biologie studies, met inbegrip van co cultuur met cellen van de gastheer om gastheer-parasiet-relaties op het niveau van de membraan receptoren, signalering en gene te onderzoeken expressie; drug testen in vitro; onderzoek van gene schrapping, mutatie of overexpressie stofwisselingsprocessen, cytoskeletal biogenese en parasiet overleven.
Introduction
De methode voorgesteld beschreven hier kunnen de scheiding van trypanosomen, parasieten die verantwoordelijk is voor mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis (hoed), uit bloed. Dit is de beste methode voor diagnose van eerste fase hoed en bovendien deze parasiet reiniging methode vergunningen robuuste serologische en onderzoek onderzoek.
HOED wordt veroorzaakt door de tseetseevlieg verzonden Trypanosoma brucei gambiense en T. b. rhodesiense1. Deze eencellige parasieten vermenigvuldigen extracellularly in de bloedsomloop, lymfe en interstitiële vocht tijdens de eerste fase van de ziekte (hemolymphatic fase). De tweede fase (meningoencephalitic fase) begint als parasieten over de bloed-hersenbarrière; neurologische symptomen, met inbegrip van een wanorde van de slaap, die haar naam “slaapziekte” aan deze ziekte heeft gegeven, zijn typerend voor deze tweede fase2. Verwante trypanosomen (T. b. brucei, T. vivax, T. congolense, T. evansi) zijn de causatieve agenten van dier Afrikaanse trypanosomosis (AAT)3.
De World Health Organization (WHO) wil elimineren hoed als een probleem voor de volksgezondheid in 2020 en stoppen van de transmissie door 20304. De recente invoering van snelle diagnose tests heeft verbeterde serologische diagnose1,4,5. Verschillende moleculair diagnostische tests zijn ontwikkeld, maar hun rol in de diagnostische gegevens van het veld nog niet is vastgesteld5. Ze worden gebruikt voor het identificeren van de sub-soorten van de brucei groep en atypische trypanosomiase veroorzaakt door parasieten die verantwoordelijk zijn voor dierlijke trypanosomosis6.
De detectie van de parasiet is essentieel voor de diagnose, de behandeling en de follow-up, zoals serologie kan valse positieve en helaas valse negatieve resultaten1geven. De directe microscopische observatie van de protisten van deze hemoflagellate is moeilijk in HAT gevallen die worden veroorzaakt door t.b. gambiense, (meer dan 95% van de gevallen) als lage parasitemias de regel zijn, terwijl voor hoed veroorzaakt door t.b. rhodesiense, een grote aantal parasieten zijn vaak aanwezig in het bloed. Verschillende concentratie technieken zijn gebruikt, zoals de daling van de dikke en capillair centrifugeren (CTC), maar de scheiding van parasieten van bloed door een kolom van anionenwisselaar (cellulose Gebondenkleurstof) gevolgd door centrifugatie en microscopische observatie van de pellet, is de meest gevoelige methode (ongeveer 50 parasieten/mL bloed kunnen worden gedetecteerd)1,7. Bijgevolg, de zuivering van trypanosomen door deze methode anion-wisselaars (cellulose Gebondenkleurstof) is de beste en, tot op heden, de referentiemethode voor het visualiseren en isoleren van parasieten uit bloed voor hoed diagnose. In veldomstandigheden, een mini kolom van cellulose Gebondenkleurstof is succesvol gebruikt en verschillende verbeteringen hebben vergemakkelijkt microscopische observatie7,8.
De methode van trypanosoom scheiding van bloed, hieronder beschreven, hangt af van parasiet oppervlakte heffing, welke minder negatief dan bloed zoogdiercellen9is. Interessant is dat deze methode 50 jaar geleden, in 1968 door Dr. Sheila Lanham werd ontwikkeld, en blijft de gouden standaard voor detectie en voorbereiding van de bloedbaan trypanosomen. Het is snel en reproduceerbare voor salivaria trypanosomen uit een breed scala van zoogdieren, de diagnose van zowel mens en dier van trypanosomiasis10het toelaat.
Met het oog op een levend, gezuiverde parasieten, wordt geïnfecteerd bloed op een anionenwisselaar kolom toegevoegd. Chromatografie voorwaarden (voornamelijk pH, Ionische sterkte van buffers/media) hebben elk trypanosoom soorten, en meer in het algemeen, worden aangepast aan elke mix van zoogdieren bloed cellen en de trypanosomen10. Elutie buffer wordt juist ingesteld op pH 8 voor de meeste Afrikaanse trypanosomen10. Deze methode geeft voorrang aan de concentratie van parasieten gevonden in het bloed van patiënten, omdat parasitemias kan te laag worden gedetecteerd door microscopische observatie alleen, en hierdoor ook laboratoriumonderzoek. Werken met vers geïsoleerde trypanosomen en op het bloed van besmette dieren, met behulp van deze techniek, is meer relevant voor verschillende onderzoeken dan studies met parasieten die in een van de omstandigheden in het laboratorium hebben zijn gekweekt voor onbepaalde tijd.
Gastheer-parasiet-relaties worden best bestudeerd met een parasiet infecteren de natuurlijke gastheer, daarom, T. musculi, een natuurlijke lymfkliertest parasiet, die representatief is voor de extracellulaire trypanosomen, heeft vele voordelen zoals lymfkliertest infectie gaat in een kleine proefdier en vereist geen biohazard veiligheidsvoorwaarden niveau (BSL). T. musculi doodt niet immunocompetent muizen, in tegenstelling tot vele andere soorten van Trypanosoma , waaronder de menselijke pathogenen. T. musculi zijn in T-cel-beroofd muizen niet geëlimineerd en parasitemias bij besmette muizen kan worden verhoogd door het wijzigen van voedsel en voedingsstoffen inname11. Deze parasiet moduleert de immuunrespons bij co-infecties met andere ziekteverwekkers12. T. musculi van geïnfecteerde muizen vertonen verschillen van gekweekte T. musculi, bijvoorbeeld de uitdrukking van membraan Fc receptoren is verloren gegaan in T. musculi Axenische culturen, in vergelijking met parasieten gezuiverd van geïnfecteerde muizen13 , 14. Excreted-uitgescheiden factoren (ESF) zijn ook kwalitatief en kwantitatief minder uitgesproken in een trypanosoom culturen en verschillen tussen stammen geïsoleerd in endemische gebieden15. ESF zijn de eerste antigenen om te worden weergegeven om het immuunsysteem van de gastheer en dus spelen een belangrijke rol in de oorspronkelijke host immuunrespons16.
In experimenteel geïnfecteerde dieren voor laboratoriumonderzoek vergemakkelijkt dit protocol experimenten met een groter aantal parasieten, minimaliseren van het aantal muizen vereist vooral bij gebruik van immunosuppressie dieren. De variant oppervlakte glycoproteïnen (VSGs) die worden gebruikt in de Card Agglutination Test for Trypanosomiasis (CATT) in mass screening zijn nog gezuiverd van trypanosomen die worden doorgegeven bij ratten. De twee snelle diagnostische tests (individueel verpakt cassettes) die nu beschikbaar zijn voor gebruik in het veld zijn nog steeds met een besmettelijk model bron van inheemse VSGs en niet in vitro gekweekt trypanosomen1,4, 5. de vooruitgang in de studie van de trypanosoom immunologie en celbiologie heeft bevorderd aangezien deze parasieten van de gezuiverde cellulose Gebondenkleurstof gemakkelijk worden in grote hoeveelheden van nature of experimenteel geïnfecteerde hosts, en met name knaagdieren verkregen kunnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gezuiverde trypanosomen vertegenwoordigen een krachtig instrument om te studeren, immunologie, biochemie, cellulaire en moleculaire biologie. Grote delen van de gegevens en resultaten zijn verkregen van trypanosomen, die vervolgens geholpen om informatie te verkrijgen van andere eukaryotische cellen30. Trypanosomen zijn ook het onderwerp van belangrijke en interessante onderzoek omdat zij talrijke mechanismen waarmee ze te overleven en te groeien in twee zeer verschillende omgevingen hebben bedach…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken alle leden van UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Dit onderzoek werd gesteund door interne financiering van de Universiteit van Bordeaux en steun van de ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, en van de Association pour le développement de la recherche nl Parasitology et médecine tropicale en de Service Coopération et d’action culturelle de ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
Riferimenti
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?. Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host’s parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
