Questo metodo di separazione Tripanosoma dal sangue dipende dalla loro carica superficiale essendo meno negativo rispetto a cellule del sangue dei mammiferi. Sangue infetto è collocato e trattati su una colonna di scambiatore di anioni. Questo metodo, più il montaggio diagnostico per la tripanosomiasi africana, fornisce parassiti purificati per indagini immunologiche, biologiche, biochimiche, farmaceutiche e biologia molecolare.
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Articolo metodologico
Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo metodo consente la separazione dei tripanosomi, parassiti responsabili di tripanosomiasi africana umana e animale (HAT), da sangue infetto. Questo è il metodo migliore per la diagnosi della prima fase cappello e inoltre questo metodo di purificazione del parassita permessi sierologico e le indagini di ricerca.
CAPPELLO è causato da Mosca Tse-Tse trasmessi Trypanosoma brucei gambiense e rhodesiense del t.b.. Trypanosomes correlate sono gli agenti causali di tripanosomiasi animale. Rilevamento di Tripanosoma è essenziale per la diagnosi, trattamento e follow-up di cappello. La tecnica qui descritta è la tecnica più sensibile di rilevazione parassita, adattata alle condizioni del campo per la diagnosi del gambiense del t.b. cappello e può essere completata entro un'ora. Sangue è a strati su una colonna di scambiatore di anioni (DEAE cellulosa) precedentemente regolata a pH 8 e tampone di eluizione viene aggiunto. Caricate altamente negativa globuli sono adsorbiti sulla colonna mentre il meno negativamente trypanosomes passano attraverso. Trypanosomes raccolti sono pellettati mediante centrifugazione e osservata da microscopia. Inoltre, i parassiti sono preparati senza danno cellulare, pur mantenendo la loro infettività.
Purificata trypanosomes sono necessari per i test immunologici; sono utilizzati nell'analisi della trypanolysis, il gold standard nella sierologia di cappello. Macchiato parassiti sono utilizzati nel test di agglutinazione di carta (CATT) per sierologia di campo. Gli antigeni da trypanosomes purificata, come variante della glicoproteina di superficie, esoantigeni, sono utilizzati anche in vari test immunologici. La procedura qui descritta è progettata per tripanosomi africani; di conseguenza, devono essere adattati per ogni ceppo di Tripanosoma e più in generale, per il sangue di ogni specie di mammifero ospite cromatografia condizioni.
Queste affascinanti gli agenti patogeni sono facilmente purificato e disponibile per l'uso biochimici, molecolari e cellulari tra cui co-coltura con cellule dell'ospite per indagare le relazioni ospite-parassita a livello dei recettori di membrana, segnalazione e gene di studi di biologia espressione; droga test in vitro; indagine di omissione del gene, mutazione o sovraespressione sui processi metabolici, biogenesi del citoscheletro e sopravvivenza del parassita.
Introduzione
Il metodo presentato descritto qui consente la separazione dei tripanosomi, parassiti responsabili di tripanosomiasi africana umana e animale (HAT), dal sangue. Questo è il metodo migliore per la diagnosi della prima fase cappello e inoltre questo metodo di purificazione del parassita permessi robusto indagine sierologica e di ricerca.
CAPPELLO è causato da Mosca Tse-Tse trasmessi Trypanosoma brucei gambiense e rhodesiense del t.b.1. Questi protozoi parassiti si moltiplicano extracellularly nella circolazione sanguigna, linfatica e fluidi interstiziali durante la prima fase della malattia (....
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Protocollo
Indagini conformano alle linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH pubblicazione n. 85±23, riveduta 1996). Protocolli sono stati approvati dal nostro comitato etico locale.
1. gli animali
- Tenere topi Swiss (OF-1) femmina invecchiati otto-dieci settimane vecchie, 20-25 g, in un animale alloggiamento impianto quindici giorni prima di ogni esperimento. Ospitarli in scatole ventilate che vengono tenuti in un protetto, temperatura (22 ° C) e umidità (50%) controllato la camera, con 12 ore ciclo di luce di accensione e spegnimento.
- Dare animali libero accesso a cibo e acqua. Ridurre al minimo dolor....
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Risultati
Trypanosomes purificati sono stati utilizzati in prove farmaceutiche. I parassiti vengono trasferiti nei pozzetti di coltura contenenti diluizioni seriali di droghe specifiche, da solo o misto19. Osservazioni al microscopio, valutazione della motilità è un indicatore della redditività, possono essere eseguite quando solo pochi Dug sono in fase di test, mentre AlamarBlue cella analisi di attuabilità è un metodo eccellente per saggi di grande motilità durante lo scre.......
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Discussione
Purificata trypanosomes rappresentano un potente mezzo per studiare immunologia, biochimica, biologia molecolare e cellulare. Grandi distese di dati e risultati sono state ottenute da trypanosomes, che ha poi contribuito a ottenere informazioni dalle altre cellule eucariotiche30. Trypanosomes sono anche oggetto di ricerca importante e interessante, perché essi hanno messo a punto numerosi meccanismi che consentono loro di sopravvivere e crescere in due ambienti molto diversi: il vettore di Mosca T.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo tutti i membri di UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti interni da Università di Bordeaux e supporto dall'ANR, LABEX ANR ParaFrap-11-LABX-0024 e dall'associazione pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale e il de servizio Coopération et d'Action culturelle de l'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10 ml di pipette | Falcon | 357.551 | |
| Pipette da 2 ml | Falcon | 352.507 | |
| Provetta per centrifugazione 50 mL | Falcon | 352.070 | |
| Centrifuga | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulosa | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| carta da filtro | Whatman | 1.001.125 | |
| Pallone a fondo piatto a collo stretto | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucosio | VWR | 101174Y | 500 G |
| Eparina | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscopio | Olympus | CH-20 | |
| Vetrini coprioggetti per microscopio | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Vetrini | per microscopioThermofisher scientifico | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026; 260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616; 262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Flaconi formato 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Flaconi formato 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipetta | VWR | BRND125400 | |
| Penicillina 10.000 UI/Streptomicina 10.000 &; g | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Fenolo rosso | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Cappa per coltura tissutale | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Anversa, Belgio). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Istituto di Medicina Tropicale (Anversa, Belgio). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
Riferimenti
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P....
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Ristampe e permessi
