Очистка внеклеточного трипаносом, в том числе африканских, от крови на Аниониты (Diethylaminoethyl целлюлоза столбцы)
Summary
Этот метод разделения трипанасомных из крови зависит от их поверхности заряда меньше отрицательных, чем клетки крови млекопитающих. Инфицированной крови помещают и лечение на столбец анионита. Этот метод, наиболее монтажа диагностики для Африканский трипаносомоз, обеспечивает очищенный паразитов для иммунологических, биологических, биохимических, фармацевтической и молекулярной биологии исследований.
Abstract
Этот метод позволяет разделение трипаносом, паразитов, ответственный за Африканский трипаносомоз животных и человека (шляпы), от инфицированной крови. Это лучший метод для диагностики первой стадии ШЛЯПУ и Кроме того этот метод паразита очищения серологических и научные исследования.
HAT вызвана цеце препроводил Trypanosoma brucei гамбийскую и T. b. rhodesiense. Связанные трипаносом уже возбудителей животных трипаносомозом. Трипанасомных обнаружение имеет важное значение для HAT диагностики, лечения и последующих мер. Метод, описанный здесь является метод обнаружения наиболее чувствительных паразита, адаптированы к условиям поля для диагностики т. б. гамбийскую ШЛЯПУ и может быть завершена в течение одного часа. Кровь накладывается на столбец анионит (открытое целлюлоза), ранее скорректирована до pH 8, и добавляется Элюирующий буфер. Крайне отрицательно заряженных клетки крови являются абсорбированном виде на столбце, в то время как менее отрицательно заряженных трипаносом проходят через. Собранные трипаносом гранулированных центрифугированием и соблюдаться микроскопии. Кроме того паразиты готовятся без повреждения клеток, сохраняя их инфективности.
Очищенный трипаносом требуются для иммунологических тестов; они используются в trypanolysis assay, золотой стандарт в ШЛЯПЕ серология. Окрашенных паразитов используются в тесте агглютинации карты (CATT) для поля серология. Антигены из очищенного трипаносом, таких как вариант поверхностный гликопротеин, exoantigens, также используются в различных иммуноанализа. Процедуру, описанную здесь предназначен для африканских трипаносом; Следовательно хроматографии условия должны быть адаптированы для каждого штамма трипанасомных и в более общем плане, в кровь каждого вида млекопитающих хост.
Эти увлекательные патогенов, легко очищенный и доступны для использования в биохимических, молекулярной и клеточной биологии исследования, включая совместное культуру с клеток хозяина расследовать паразито хозяинных отношений на уровне мембранных рецепторов, сигнализации и Джин выражение; наркотиками испытания в vitro; расследование удаления генов, мутации или гиперэкспрессия на метаболические процессы, цитоскелета биогенеза и выживания паразита.
Introduction
Представлен метод описанные здесь позволяет разделение трипаносом, паразитов, ответственный за Африканский трипаносомоз животных и человека (шляпы), от крови. Это лучший метод для диагностики первой стадии ШЛЯПУ и Кроме того, этот паразит метод очистки позволяет надежные серологических и исследовательские расследования.
HAT вызвана цеце препроводил Trypanosoma brucei гамбийскую и T. b. rhodesienseв1. Эти паразиты простейших умножить внеклеточно в крови, лимфы и межклеточной жидкости во время первой стадии заболевания (Гемолимфатический этап). Второй этап (meningoencephalitic этап) начинается, когда паразитов пересечь гематоэнцефалический барьер; неврологические проявления, включая расстройства сна, который дал свое имя «сонная болезнь» к этой болезни, типичны для этого второго этапа2. Связанные трипаносом (т. evansi, т. congolense, т. vivax, т. б. brucei) уже возбудителей животных африканского трипаносомоза (АС)3.
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) стремится устранить ШЛЯПУ как проблемы общественного здравоохранения к 2020 году и остановить передачу 20304. Недавнее введение тестов быстрой диагностики имеет улучшенный Серологический диагноз1,4,5. Были разработаны несколько молекулярных диагностических тестов, но их роль в области диагностики до сих пор не установленным5. Они используются для идентификации подвидов brucei группы и атипичные трипаносомоз, вызванные паразитами, ответственных за животных трипаносомозом6.
Обнаружение паразит имеет важное значение для диагностики, лечения и последующих мер, как серология может дать ложные положительные и к сожалению ложные отрицательные результаты1. Прямого микроскопические наблюдения этих простейших hemoflagellate трудно в случаях ШЛЯПУ, которые вызваны т. б. гамбийскую, (больше чем 95% случаев) как низкий parasitemias являются правилом, тогда как для HAT вызванных T. b. rhodesiense, большой Количество паразитов часто присутствуют в крови. Были использованы различные методы концентрации, как толстая капля и капиллярной трубки центрифугирования (КТК), но разделение паразитов от крови по столбцу анионита (открытое целлюлоза) следуют центрифугирования и микроскопические наблюдения Пелле, является наиболее чувствительным методом (около 50 паразитов/мл крови могут быть обнаружены)1,7. Следовательно, очистки трипаносом этим методом Аниониты (открытое целлюлоза) является лучшим и, на сегодняшний день, эталонный метод для визуализации и изоляции паразитов из крови для диагностики ШЛЯПУ. В полевых условиях успешно используется мини-колонки открытое целлюлозы и несколько улучшений способствовали микроскопические наблюдения7,8.
Метод отделения трипанасомных от крови, описанные ниже, зависит от поверхности заряд паразита, который меньше отрицательных, чем клетки крови млекопитающих9. Интересно, что этот метод был разработан 50 лет назад, в 1968 году д-р Шейла Ланхем и остается золотым стандартом для обнаружения и подготовка трипаносом кровоток. Это быстро и воспроизводимый для salivarian трипаносом из широкого спектра млекопитающих, позволяя диагноз как трипаносомоз животных и человека10.
Получить жизни, очищенный паразитов, инфицированной крови добавляется на столбец анионита. Условия хроматографии (главным образом, pH, ионной силы буферы/СМИ) должны быть адаптированы для каждого вида трипанасомных и вообще, каждый микс mammalian клеток крови и трипаносом10. Элюирующий буфер точно скорректирована с pH 8 для большинства африканских трипаносом10. Этот метод способствует концентрации паразитов в крови больных, потому что parasitemias может быть слишком низким для того чтобы быть обнаружены микроскопические наблюдения в одиночку, и она также позволяет лабораторных исследований. Работа с свежевыделенных трипаносом и на крови от инфицированных животных, используя эту технику, более актуально для различных расследований, чем исследования с паразитами, которые были культивировали в стерильных условиях в лаборатории на неопределенный срок.
Паразито хозяинных отношений наилучшим учился с паразита заражения природного хозяина, таким образом, т. musculi, естественный мышиных паразита, который является представителем внеклеточного трипаносом, имеет много преимуществ, как мышиных инфекции включает в мелких лабораторных животных и не требует биологической безопасности уровня (BSL) условий. Т. musculi не убить иммунокомпетентных мышей, в отличие от многих других видов Трипаносомы , в том числе патогенов человека. Т. musculi не устраняются в Т клеток, лишенные мышей и parasitemias может быть увеличена в зараженных мышей, изменяя потребление продовольствия и питательных веществ11. Этот паразит модулирует иммунный ответ в сопутствующих инфекций с других патогенов12. Т. musculi от зараженных мышей экспонат отличия от искусственного musculi т., например, выражение мембранных рецепторов ФК теряется в стерильных культурах musculi т. , по сравнению с паразитами, очищенного от зараженных мышей13 , 14. Экскретируется выделяется факторы (ESF) также качественно и количественно менее выражена в стерильных трипанасомных культур и отличаются между штаммы изолированы в эндемичных районах15. ЕФС являются первым антигенов, чтобы отображаться иммунной системы и поэтому играют важную роль в начального узла иммунный ответ16.
В экспериментально зараженных животных для лабораторных исследований этот протокол облегчает эксперименты на большее количество паразитов, свести к минимуму количество мышей, особенно при использовании ослабленным животных. Вариант поверхностных гликопротеинов (VSGs), которые используются в тесте агглютинации карты трипаносомоза (CATT) в массового скрининга по-прежнему очищенного от трипаносом, которые распространяются в крыс. Два быстрых диагностических тестов (индивидуально упакованные кассеты), которые теперь доступны для использования на местах, по-прежнему используют источник инфекционный модель родной VSGs и не в vitro культивированный трипаносом1,4, 5. улучшения в изучении биологии и иммунологии трипанасомных способствовало поскольку эти паразиты очищенной целлюлозы открытое можно легко получить в больших количествах из естественно или экспериментально зараженных узлов и в частности, грызуны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Очищенный трипаносом представляют собой мощное средство для изучения иммунологии, биохимии, клеточной и молекулярной биологии. Большие просторы данных и результаты были получены из трипаносом, который затем помог получить информацию от других эукариотических клеток30. Т?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех членов UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Это исследование было поддержано внутреннего финансирования от университета Бордо и поддержки от НРУ, LABEX нар ParaFrap-11-LABX-0024 и ассоциации pour le développement de la recherche en parasitologie et Медисин tropicale и службы де Кооперасьон et действий culturelle де l’Ambassade де Франс меню Банги (банковский).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
Riferimenti
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?. Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host’s parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
