Afrika, anyon-değiştiriciler (Diethylaminoethyl-selüloz sütunlar) tarafından kandan da dahil olmak üzere hücre dışı Tripanozomlar arıtma
Summary
Bu yöntem kan trypanosome ayrılma memeli kan hücreleri daha az negatif olmak onların yüzey şarj bağlı olarak değişir. Enfekte kan yerleştirilir ve bir anyon değiştirici sütun tedavi. Bu yöntem, en uygun teşhis için Afrika tripanozomiyasına, immünolojik, biyolojik, biyokimyasal, ilaç ve moleküler biyoloji İncelemeler için saflaştırılmış parazitler sağlar.
Abstract
Bu yöntem Tripanozomlar, parazit bulaşmış kan hayvan ve insan Afrika tripanozomiyasına için (HAT), sorumlu ayırma verir. Bu ilk aşamasının şapka tanı için en iyi yöntem ve ayrıca bu parazit arıtma yöntemi serolojik izin verir ve araştırmalar araştırma.
ŞAPKA çeçe sineği aktarılan Trypanosoma brucei gambiense tarafından neden olduğu ve T. b. rhodesiense. İlgili Tripanozomlar hayvan tripanozomiyasına sorumlu ajanlar. Trypanosome algılama şapka tanı, tedavi ve takibi için esastır. Burada açıklanan tekniği alan koşulları T. b. gambiense şapka tanı için uyarlanmış en hassas parazit algılama teknik ve bir saat içinde tamamlanabilir. Kan pH 8 daha önce ayarlanmış bir anyon değiştirici sütuna (DEAE selüloz) katmanlı ve elüsyon arabellek eklenir. Daha az olumsuz ücret Tripanozomlar geçmesine ise son derece olumsuz dolu kan hücreleri sütun adsorbe. Toplanan Tripanozomlar Santrifüjü tarafından pelleted ve mikroskopi tarafından görülmektedir. Ayrıca, parazitler hücresel hasar onların infektivite muhafaza ederken hazırlanır.
Arıtılmış Tripanozomlar immünolojik test etmek için gerekli olan; Bunlar trypanolysis tahlil, şapka seroloji altın standart kullanılır. Lekeli parazitler alan seroloji kartı Aglutinasyon test (CATT) kullanılmaktadır. Antijenler gibi değişik yüzey glikoprotein, exoantigens, saflaştırılmış Tripanozomlar üzerinden de çeşitli uzun kullanılır. Burada açıklanan yordamı Afrika Tripanozomlar için tasarlanmıştır; Sonuç olarak, Kromatografi koşulları her trypanosome zorlanma ve daha genel olarak, her tür Ana Memeli kan için adapte zorunda.
Bu patojenler büyüleyici kolayca saflaştırılmış ve kullanmak kullanılabilir vardır biyokimyasal, moleküler ve hücre membran reseptörleri, sinyal ve gen düzeyinde ana bilgisayar-parazit ilişkileri araştırmak için konak hücreleri ile ortak kültür Biyoloji çalışmaları ifade; test içinde in vitroilaç; Gen silme, mutasyon veya metabolik süreçleri, hücre iskeleti Biyogenez ve parazit hayatta kalma overexpression incelenmesi.
Introduction
Yöntemi sunulan açıklanan burada Tripanozomlar, parazitler kan hayvan ve insan Afrika tripanozomiyasına için (HAT), sorumlu ayırma verir. Bu ilk aşamasının şapka tanı için en iyi yöntem ve ayrıca bu parazit arıtma yöntemi sağlam serolojik ve araştırma soruşturma izni.
ŞAPKA çeçe sineği aktarılan Trypanosoma brucei gambiense ve T. b. rhodesiense1ile. neden olur Bu protozoon parazitler (hemolymphatic sahne) hastalığın ilk aşamasında extracellularly kan, lenf ve interstisyel sıvı ile çarpın. Parazitler kan beyin bariyerini geçerken ikinci sahne (meningoencephalitic sahne) başlar; Onun adı “uyku hastalığı” Bu hastalığı verdi, bir uyku bozukluğu dahil olmak üzere nörolojik belirtiler bu ikinci aşama2/ tipik vardır. İlgili Tripanozomlar (T. evansi, T. congolense, T. Samsung, T. b. brucei) hayvan Afrika trypanosomosis (AAT)3sorumlu ajanlar.
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) şapka bir halk sağlığı sorunu 2020 yılına kadar ortadan kaldırmak ve iletim 20304tarafından durdurmak için amaçlamaktadır. Geliştirilmiş serolojik tanı1,4,5hızlı tanı testleri son giriş vardır. Birkaç moleküler tanı testleri geliştirilmiştir ancak onların rol alan teşhis kurulan5henüz olmamıştır. Bunlar brucei grup ve atipik tripanozomiyasına parazitler için hayvan trypanosomosis6sorumlu nedeniyle alt türler tanımlamak için kullanılır.
Seroloji yanlış pozitif ve ne yazık ki yanlış negatif sonuçlar1vermek gibi parazit tespiti tanı, tedavi ve takip, için esastır. Bu hemoflagellate protistalar doğrudan microscopical gözlenmesi düşük parasitemias kural olarak T. b. gambiense, (vakaların % 95’den fazla) tarafından şapka için T. b. rhodesiensetarafından bir büyük neden ise neden olduğu şapka durumlarda zordur parazit sayısı sık kanda mevcuttur. Çeşitli toplama teknikleri, kalın damla ve kılcal tüp Santrifüjü (CTC), gibi kullanılmaya başlandı ama parazitler ayrımı anyon değiştirici (DEAE selüloz) bir sütun tarafından kandan ardından Santrifüjü ve mikroskobik gözlenmesi ekleyin cips, en hassas yöntemi (yaklaşık 50 parazitler/mL kan tespit)1,7. Sonuç olarak, bu anyon-değiştiriciler (DEAE selüloz) yöntemi tarafından Tripanozomlar arıtma en iyisi ve bugüne kadar görselleştirme ve şapka tanı için kan parazitleri izole için başvuru yöntemi. Alan koşullarında DEAE selüloz mini bir sütun tanımladınız ve çeşitli iyileştirmeler microscopical gözlem7,8kolaylaştırdı.
Trypanosome ayrılık kan, aşağıda açıklanan yöntem memeli kan hücreleri9daha az negatif parazit yüzey şarj bağlıdır. İlginçtir, bu yöntem 50 yıl önce Dr Sheila Lanham tarafından 1968 yılında geliştirildi ve algılama ve kan dolaşımına Tripanozomlar hazırlanması için altın standart kalır. Hızlı ve salivarian Tripanozomlar memeliler, her iki hayvan ve insan tripanozomiyasına10tanısında izin geniş bir dizi için tekrarlanabilir.
Canlı, saf parazitler elde etmek için enfekte kan bir anyon değiştirici sütun eklenir. Kromatografi koşulları (esas olarak pH, iyonik gücü arabellekleri/medya) her trypanosome türler için ve daha genel olarak, her memeli kan hücreleri ve Tripanozomlar10karışımı için adapte zorunda. Elüsyon arabellek tam olarak pH 8 birçok Afrika Tripanozomlar10için ayarlanır. Parasitemias mikroskobik gözlem yalnız tarafından algılanması için çok düşük olabilir, çünkü bu yöntem hastalar, kanda bulunan parazit konsantrasyonu ayrıcalıklı kılar ve ayrıca laboratuvar araştırma sağlar. Çalışma taze izole Tripanozomlar ile bu tekniği kullanarak enfekte hayvanlardan kan daha çeşitli araştırmalar için çalışmalar laboratuvarda axenic koşullarda belirsiz süreli kültürlü parazit daha uygun.
Ana bilgisayar-parazit ilişkileri en iyi doğal ana bilgisayar, bu nedenle, hastalık bir parazit T. musculi, doğal bir fare parazit ekstraselüler Tripanozomlar temsilcisidir, fare enfeksiyonu da karıştırmak gibi pek çok avantajı vardır ile okudu bir küçük laboratuvar hayvanı ve biohazard güvenlik düzeyi (BSL) koşulları gerektirmez. T. musculi insan patojenleri de dahil olmak üzere diğer birçok Trypanosoma türler aksine immün fare öldürmek değil. T. musculi değil T hücre yoksun farelerde ortadan ve parasitemias gıda ve besin alımını11değiştirerek virüslü farelerde artırılabilir. Bu parazit bağışıklık yanıtı diğer patojenleri12ile birlikte enfeksiyonlar modüle. T. musculi kültürlü T. musculi, gelen virüslü fareleri sergi farklar üzerinden örneğin, membran Fc reseptörleri ifade T. musculi axenic kültürleri, virüslü fareleri13 saf parazitler karşılaştırıldığında kaybolur , 14. Excreted salgıladığı faktörler (ESF) da nitelik ve nicelik daha az ifade axenic trypanosome kültürlerde ve endemik alanları15dakika içinde izole suşları arasında farklılık gösterir. ESF ana bağışıklık sistemi için var olmak göstermek ve bu yüzden bağışıklık yanıtı16ilk ana önemli bir rol oynamak için ilk antijenleri vardır.
Laboratuvar araştırmalar için deneysel olarak enfekte hayvanlarda bu protokol üzerinde parazitler özellikle baskılanmış hayvanlar kullanırken gerekli fare sayısını en aza indirme, daha çok sayıda deneme kolaylaştırır. Kart Aglutinasyon Test tripanozomiyasına (CATT) kitle tarama kullanılır varyant yüzey glikoproteinlerin (VSGs) yine de, fareler yayılır Tripanozomlar gelen saf. Şimdi alanda, kullanım için kullanılabilir olan iki hızlı tanı testleri (tek tek sarılı kaset) yerel VSGs ve kültürlü vitro Tripanozomlar1,4, bir infektif modeli kaynak kullanmaya devam 5. bu DEAE saf selüloz parazitler kolayca doğal olarak veya deneysel olarak virüslü bilgisayarlardan büyük miktarlarda ve belirli, Rodents elde edilebilir ondan beri trypanosome İmmünoloji ve Biyoloji çalışma gelişme kolaylaştırdı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arıtılmış Tripanozomlar İmmünoloji, biyokimya, hücresel ve moleküler biyoloji çalışma için güçlü bir araç temsil eder. Veri ve sonuçları büyük expanses Tripanozomlar elde edilmiştir hangi sonra diğer ökaryotik hücreler30‘ dan itibaren bilgi edinmek için yardımcı oldu. Çünkü onlar hayatta ve iki çok farklı ortamlarda büyümeye izin vermek çok sayıda mekanizmaları tasarlanmış Tripanozomlar önemli ve ilginç araştırma Ayrıca vardır: çeçe sineği vektör ve…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz tüm üyeleri UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux, teşekkür ederim. Bu araştırma iç Bordeaux Üniversitesi fon tarafından desteklendi ve destek LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 ANR ve derneğin pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale ve hizmet de coopération et d’action culturelle de l’Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
Riferimenti
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?. Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host’s parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
