Qui presentiamo un biosensore basato su luciferase per quantificare l'attività della chinasi del soppressore del tumore grande (LATS)-una centrale chinasi della via di segnalazione di Ippona. Questo biosensore ha diverse applicazioni nella ricerca di base e traslazionale, volta ad indagare Hippo pathway regolatori in vitro e in vivo.
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Articolo metodologico
Monitoraggio di Hippo segnalazione attività di via utilizzando un biosensore di basati su Luciferase grande tumore soppressore (LATS)
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ippopotamo via di segnalazione è un regolatore conservato della dimensione dell'organo e ha ruoli importanti nella biologia sviluppo e cancro. A causa di problemi tecnici, resta difficile valutare l'attività di questa via di segnalazione e interpretarla all'interno di un contesto biologico. La letteratura esistente sulla grande oncosoppressore (LATS) si basa su metodi qualitativi e non possono facilmente essere su vasta scala per lo screening. Recentemente, abbiamo sviluppato un biosensore basato su bioluminescenza per monitorare l'attività della chinasi di componente di LATS-a base della cascata della chinasi di ippopotamo. Qui, descriviamo le procedure per come questo biosensore LATS (LATS-BS) può essere utilizzato per caratterizzare i regolatori della via di ippopotamo. In primo luogo, forniamo un protocollo dettagliato per lo studio dell'effetto di un candidato di proteina overexpressed (ad es., VEGFR2) sull'attività LATS utilizzando il LATS-BS. Quindi, vi mostriamo come il LATS-BS può essere utilizzato per uno schermo di inibitore di chinasi su piccola scala. Questo protocollo può essere concretamente su vasta scala per eseguire schermi più grandi, che senza dubbio individuerà nuovi regolatori del pathway di ippopotamo.
Introduzione
L'ippopotamo signaling pathway è stato identificato in Drosophila come un romanzo regolatore di crescita delle cellule e animali dimensione1,2. Fin dalla sua scoperta iniziale, le prove crescenti ha dimostrato in modo convincente che il pathway di Hippo svolge ruoli critici nello sviluppo (per esempio, lo sviluppo embrionale precoce, controllo delle dimensioni dell'organo e morfologia tridimensionale [3D]), nella tumorigenesi ( ad esempio, lo sviluppo del tumore, metastasi, l'angiogenesi, evasione immune, instabilità genomica, risposta allo stress e resistenza ai farmaci) e dell'omeo....
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Protocollo
1. indagine di un putativo regolatore di Hippo segnalazione utilizzando il LATS-BS
-
Placcatura e transfezione delle celle
- Preparazione della coltura delle cellule
- Caldo, 1x PBS DMEM contenente 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina e 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C a bagnomaria per circa 30 min.
- Pulire un mobile di biosicurezza con etanolo al 70%.
- Piatti di coltura del tessuto, le pipette Pasteur, pipette sierologiche e puntali per inserire il cappuccio di coltura del tessuto come richiesto.
- Prendere fuori 1X PBS, i media e la tripsina-EDTA dal bagnomaria, pulirli con etanolo al 70% e met....
- Preparazione della coltura delle cellule
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Risultati
Il LATS-BS è stato cotransfected con geni differenti per valutare il loro effetto sull'attività LATS (Figura 3). In questo esperimento, Renilla è stato utilizzato come controllo interno. L'espressione transitoria di YAP-5SA, una forma attiva costitutiva di YAP, cause aumentando i livelli di target trascrizionali YAP e un successivo incremento nell'attività della chinasi lettoni attraverso un feedback stabiliti percorso25. MST,.......
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Discussione
Mentre la via di Hippo svolge ruoli critici in vari processi biologici e disregolazione del pathway Hippo conduce a cancro6, come il pathway di Hippo è regolamentato in risposta a vari stimoli completamente non è capito. Inoltre, c' non è stato nessun sistema quantitativo e in tempo reale per valutare l'attività dei componenti di base di ippopotamo. Recentemente, abbiamo sviluppato e validato un biosensore romanzo per misurare l'attività della chinasi lettoni del Hippo pathway24<.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dall'Istituto canadese di ricerca salute (CIHR n. 119325, 148629) e la Fondazione canadese per la cancro seno (CBCF) a XY. TA è supportato dalla borsa di studio di laurea Canada Vanier e Ontario International Graduate Scholarship. HJJVR è supportato da una regina Elizabeth II Graduate Scholarship in scienza e tecnologia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| tripsina-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0,25% |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM ad alto contenuto di glucosio |
| Penicillina Streptomicina | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro Reagente di trasfezione del DNA | Signagen | SL100688,5 | |
| 5x Tampone di lisi passiva | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Sistema di dosaggio della luciferasi | Promega | E2940 | kit da 100 ml |
| 20/20 luminometro | Turner Biosystems | 998-2036 | Luminometro con lettore a tubo singolo |
| GloMax® Navigatore con doppio iniettore | Promega | GM2010 | Luminometro lettore piastre a 96 pozzetti |
Riferimenti
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W.
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Ristampe e permessi
