诱导和可逆显性阴性 (dn) 蛋白抑制
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以开发一个显性负诱导系统, 在其中任何蛋白质可以有条件地灭活, 可逆地过度表达它的控制负极突变版本。
Abstract
显性阴性 (dn) 蛋白抑制是一种强大的蛋白质功能操作方法, 与其他基于基因组的方法相比具有多种优势。例如, 尽管嵌合和Cre-LoxP靶向策略已被广泛使用, 但这些策略的内在局限性 (即泄漏启动子活性、马赛克cree 表达等) 在很大程度上限制了它们的应用。此外, 完全删除许多内源基因是胚胎致死, 因此不可能研究出生后生活中的基因功能。为了应对这些挑战, 我们对早期的基因工程协议进行了重大修改, 并将 rb1 基因的短 (转基因) 版本与溶酶体蛋白酶原酶 b (cb) 结合起来, 生成 rb1 (cbrb) 的 dn 小鼠模型。由于溶酶体蛋白酶的存在, 整个 cb-rb1 融合蛋白及其相互作用的复合蛋白被路由, 以促进蛋白酶体介导的降解。此外, 在转基因结构中存在四环素诱导剂 (rtta) 元素, 使 rtTA 蛋白具有诱导性和可逆性调节。cbrb 小鼠模型中无处不在的 rosa-cag 启动子的存在使其成为进行瞬态和可逆 rb1 基因消融的有用工具, 并为研究人员提供了一种资源, 以了解其在几乎任何表达 rb1 的细胞类型中的活性。
Introduction
大多数针对基因和蛋白质消融的方法依赖于永久过程, 这通常会导致基因、rna 序列或感兴趣的蛋白质 (poi) 的完全消除或截断。该方法的总体目标是设计重组蛋白, 以消除内源性野生型蛋白的功能。我们重新审视并改进了替代策略1,2, 该策略允许通过 dn 抑制临时消融 poi。这种方法适用于多聚肽和单体肽, 但最适合在多聚体组装中发挥作用的蛋白质。
该方法包括将溶酶体蛋白酶 cb 融合到一个亚基的一个多聚类 poi (cb 融合复合体)。由此产生的 cb 融合复合物可以与内源蛋白相互作用并进行蛋白溶解消化, 或将整个 cb-poi 复合体转移到降解的溶酶体3。此外, cb 融合复合物与四环素控制转录激活 (teto) 系统的诱导性质相结合, 可实现可逆转方式的转基因诱导和可控表达。虽然在许多情况下有用, 但在体内完全删除基因或蛋白质会导致致死性 4,5,6。同样, 使用 cre/lox 系统对某些基因或蛋白质进行组织特异性、有条件的删除可能并不简单, 因为它最终会导致关键基因组元素7的永久丢失。因此, 根据基因或 poi 的不同, 这两种方法都不能有效地为后续研究提供有用的模型, 特别是产后后期和成年小鼠的基因或蛋白质功能研究。
为了避免与这些方法相关的问题, 并提供有关该方法有效性的原则验证, 我们选择通过生成视网膜母细胞瘤 1 (rb1) 蛋白的条件 dn 版本来测试此处提供的方法。提出了若干备选方案8、9、10, 以取消内生 rb1 的功能;然而, 他们都面临着一些相同的限制, 上面讨论: 永久的胚系删除 rb1 是胚胎上致命的, 并与它的肿瘤抑制作用, 永久 rb1 条件删除导致各种肿瘤11。尽管 rb1 的 dn 版本似乎不是自然发生的, 但对于目前可用的策略, 更好的替代方案应该允许对内生 rb1 进行时间控制的停用, 并提供一种替代机制, 最终恢复其功能。这种结构的基础在20多年前被描述了1。然而, 由于技术的局限性, 它缺乏控制转基因激活、反应和组织特异性的机制。本研究首次将多西环素 (dox) 依赖转录系统的优雅与溶酶体蛋白酶 cb 和rb1蛋白的工程转基因结构结合起来。由此产生的 cbrb 鼠标模型允许暂时调节 dox 介导的 rb1 规则2。使用这种基于蛋白质的方法来研究基因功能的好处是, 它可以用于任何感兴趣的基因, 而很少有关于其活性的信息。
与传统方法相比, 提出的 dn 转基因策略具有许多优势。首先, dn 蛋白抑制只导致蛋白质活性的部分消融, 从而保持残留的内源性表达。在完全消除蛋白质活性导致胚胎死亡的情况下, 这样的结果是非常可取的, 这极大地限制了任何研究活老鼠基因功能的研究。其次, teto 系统的存在使转基因激活只有在抗生素存在的情况下才能实现, 从而能够有效和可逆转地控制转基因活动。因此, 通过停止抗生素的管理, 转基因系统可以被停用, 正常的 rb1 表达恢复到原状。第三, 转基因表达的特异性可能因选择的启动子而异。虽然我们选择了无处不在的 rosa-cag 启动子进行原理证明, 但将转基因置于组织特异性启动子之下可能会限制不需要的转基因表达, 并有助于对这种转基因的治疗应用的研究方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了规避与传统转基因策略相关的限制, 我们试图生成一个鼠标模型, 在这种模型中, 内源性 poi 可以通过以时空方式过度表达 dn 突变形式来有条件地失效。为了消除内生 poi 的功能, 提出了几个备选方案15、16、17。我们已经修改了早期的遗传策略1 , 结合了 dox 依赖转录系统, 以一个简单的策略, 利用溶酶体蛋白?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pCS2+CB-myc6 向量是马歇尔·霍维茨 (华盛顿大学, 西雅图, 美国) 的礼物。hei-oc1 细胞由 fedrico kalinec (david geffen 医学院, ucla, los angeles, ca, usa) 提供。地雷行动中心小鼠基因组工程核心 (c. b. gurumurthy, don harms, rolen quadros) 和 creighton 大学生物医学综合成像设施 (richard hallworth, john billheimer) 提供了技术支持。m科员部队小鼠基因组工程得到了 NIH/NIGMS 颁发的机构发展奖 (ida) 的支持, 该奖项编号为 p20 GM103471。综合生物医学成像设施得到了克雷顿大学医学院的支持, 并从 nih/iggms 获得了 gm103427 和 gm110768。该设施是在国家研究资源中心 (rr016469) 和 nigms (gm103427) 的赠款支持下建造的。这项研究中产生的老鼠线维持在克里顿大学的动物资源设施, 该基金的基础设施通过 nihx/ncrr g20r024001 的赠款得到改善。这项工作得到了过去的支持, 得到了 nihxcr 5p20r01888-nhhmnigms 8p20gm103471 cobre 赠款 (向 shelley d. 史密斯)、nih/orip r21od01975-01a1 (s. m. r.-s.) 和听力健康基金会 (至 s. tarang) 的一笔新兴研究赠款。这项研究的内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
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