Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Dominant-negativen induzierbaren System zu entwickeln, in der kein Protein bedingt inaktiviert durch reversibel überexprimiert eine Dominant-negativen mutierte Version davon.
Abstract
Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung ist eine leistungsfähige Methode, Proteinfunktion zu manipulieren und bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Genom-basierte Ansätze. Zum Beispiel obwohl Chimären und Cre-LoxP gezielte Strategien sind am meisten benutzt, die immanente Grenzen dieser Strategien (z. B. undichte Promotoraktivität, Mosaik Cre Ausdruck usw.) erheblich eingeschränkt haben ihre Anwendung. Darüber hinaus ist eine vollständige Löschung von vielen endogenen Genen Hochkultur tödlich, macht es unmöglich, die Genfunktion in postnatale Leben zu studieren. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir erhebliche Änderungen an einem frühen Gentechnik-Protokoll und kombiniert eine Kurzversion (transgene) das Rb1-gen mit einer lysosomalen Protease procathepsin B (CB), einem DN-Maus-Modell von Rb1 generieren (CBRb). Aufgrund des Vorhandenseins von lysosomalen Protease werden die gesamten CB-RB1-Fusionsprotein und seinen interagierenden Komplex für Proteasom-vermittelten Abbau weitergeleitet. Darüber hinaus ermöglicht das Vorhandensein von ein Tetracyclin-Induktor (RtTA) Element in der transgenen Konstrukt eine induzierbare und reversibel Regelung des das RB1-Protein. Das Vorhandensein eines allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promotors im Mausmodell CBRb macht es ein nützliches Werkzeug, um vorübergehende und reversible Rb1-gen-Ablation durchführen und liefern Forscher eine Ressource für das Verständnis ihrer Tätigkeit in nahezu jedem Zelltyp wo RB1 zum Ausdruck.
Introduction
Die meisten Ansätze mit dem Ziel der Gene und Proteine Ablationen setzen auf permanente Prozesse, die in der Regel zur vollständigen Beseitigung oder Kürzung des Gens, RNA-Sequenzen oder Protein von Interesse (POI) führen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist ein rekombinantes Protein zur Abschaffung der endogenen, Wildtyp Protein-Funktion zu konstruieren. Wir haben neu aufgelegt und überarbeitet eine alternative Strategie1,2, die für die temporäre Ablation eines POI durch DN Hemmung ermöglicht. Diese Methode funktioniert für Multimeric und Monomeren Peptide aber eignet sich am besten für Proteine, die in einer Assembly Multimeric funktionieren.
Die Methode besteht darin, der Verschmelzung der lysosomalen Protease CB an eine Untereinheit von einem Multimeric POI (CB Fusion Komplex). Die resultierende komplexe CB-Fusion kann interagieren mit und proteolytisch das körpereigene Protein zu verdauen oder umleiten den Gesamtkomplex der CB-POI zu den Lysosomen abgebaut3sein. Darüber hinaus ermöglicht eine Kombination aus der komplexen CB-Fusion mit der induzierbaren Natur des Systems der Tetracyclin-gesteuerte transkriptionelle Aktivierung (TetO) einen induzierbaren und kontrollierte Expression des Transgens in einem reversiblen Mode2. Obwohl in vielen Fällen nützlich, führt die vollständige Löschung von Genen oder Proteinen in-vivo Letalität4,5,6. Ebenso gewebespezifischen, bedingte Löschung einiger Gene oder Proteine mit dem Cre/Lox-System einfach, möglicherweise nicht da es letztlich zu den dauerhaften Verlust von kritischen genomische Elemente7führt. Daher, je nach gen oder POI, keiner dieser Ansätze werden wirksam bei der Bereitstellung eines nützlichen Modells für nachfolgende Studien, besonders Gene oder Proteine funktionellen Studien in den späten postnatale und Erwachsenen Mäusen.
Zur Umgehung der Probleme im Zusammenhang mit solchen Ansätzen und Proof of Principle über die Wirksamkeit des vorgeschlagenen Verfahrens, möchten wir hier durch die Erzeugung einer bedingten DN-Version des Proteins Retinoblastom 1 (RB1) vorgestellte Methode zu testen. Mehrere Möglichkeiten wurden vorgeschlagenen8,9,10 , die Funktion des endogenen RB1 abzuschaffen; jedoch alle den gleichen Einschränkungen oben diskutierten konfrontiert: permanente Keimbahn Löschung von RB1 ist Hochkultur tödlich, und mit seinen Tumorsuppressor Rolle, permanente RB1 bedingte Löschung führt zu einer Vielzahl von Tumoren11. Obwohl eine DN-Version von RB1 nicht natürlich vorkommen scheint, sollte eine bessere Alternative zu den derzeit verfügbaren Strategien erlauben eine zeitlich gesteuerte Inaktivierung von endogenen RB1 und bieten einen alternativen Mechanismus schließlich wiederherstellen ihrer Funktion. Die Grundlage für ein solches Konstrukt wurde vor über zwei Jahrzehnten beschrieben1. Allerdings fehlte es aufgrund von technischen Einschränkungen, einen Mechanismus zur Kontrolle Transgen Aktivierung, Reaktion und Gewebespezifität. Diese Studie ist die erste verbinden die Eleganz der Doxycyclin (Dox)-abhängige transkriptionelle System mit ein veränderter transgenen Konstrukt der lysosomalen Protease CB und Rb1 Proteine. Die daraus resultierende CBRb-Maus-Modell ermöglicht eine vorübergehend geregelten Dox-vermittelten RB1 Verordnung2. Der Vorteil der Verwendung eines Proteom-basierten Ansatzes Genfunktion zu studieren ist, dass es für jedes Gen von Interesse, mit minimalen Informationen über seine Tätigkeit angenommen werden kann.
Die vorgeschlagene DN-Transgen-Strategie bietet viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Ansätzen. Erstens führt DN Protein Hemmung zu nur ein teilweiser Ablation Proteinaktivität, um ein passives endogenen Ausdruck. Ein solches Ergebnis ist höchst wünschenswert, in Situationen, wo eine vollständige Beseitigung der Proteinaktivität zu embryonalen Tödlichkeit führt, stark begrenzen jeder Untersuchung um Genfunktion in einer live Maus zu untersuchen. Zweitens ermöglicht die Präsenz des Systems der TetO Transgen Aktivierung nur in Anwesenheit eines Antibiotikums, die für eine effiziente und reversible Kontrolle der Transgen-Aktivität ermöglicht. So durch Beendigung der Antibiotika-Administration, die transgenen System kann deaktiviert werden, und ein normaler RB1 Ausdruck ist wieder an Ihrem Platz. Drittens kann der Veranstalter der Wahl die Spezifität des Transgens Ausdrucks abhängig. Während wir die allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promoter für Proof of Principle gewählt haben, dürfte Platzierung des Transgens unter gewebespezifischen Promoter, Studien über die therapeutische Anwendung von diesem Transgen zu unerwünschten Transgene Ausdruck zu beschränken Methodik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die Grenzen verbunden mit traditionellen transgene Strategien zu umgehen, haben wir versucht, ein Mausmodell zu generieren, in denen eine endogene POI bedingt inaktiviert durch ein DN mutierte Form des es in gewissem Sinne raumzeitlichen überexprimiert. Um die Funktion des endogenen POIs abschaffen zu können, wurden mehrere Optionen vorgeschlagenen15,16,17. Durch die Kombination der Dox-abhängige transkriptionellen Systems…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die pCS2 + CB-Myc6 Vektor war ein Geschenk von Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). Die HEI-OC1 Zellen wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Technischer Support sorgte die UNMC Maus Genom Engineering Core (c.b. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) und der Creighton Universität integrierte Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). Gewähren Sie durch eine institutionelle Development Award (IDea) von der NIH/NIGMS UNMC Maus Genom Engineering unterstützt wurde, Nummer P20 GM103471. Die integrierte biomedizinische Bildgebung Anlage wurde von der Creighton University School of Medicine und Stipendien, GM103427 und GM110768 von der NIH/NIGMS unterstützt. Die Anlage wurde mit Unterstützung durch Zuschüsse aus dem National Center for Research Resources (RR016469) gebaut und die NIGMS (GM103427). Die Mauslinien erzeugt in dieser Studie wurden auf Creighton University Animal Ressource Facility, gehalten dessen Infrastruktur durch einen Zuschuss von NIH/NCRR G20RR024001 verbessert wurde. Diese Arbeit vorbei an Unterstützung durch ein NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE gewähren (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) und einer aufstrebenden Forschungsstipendium aus der Anhörung Health Foundation (zu S. Tarang) erhalten. Der Inhalt dieser Forschung ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
Riferimenti
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