עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לפתח מערכת inducible דומיננטה-שלילי, שבו כל חלבון יכול להיות מותנה מומת על ידי הפיכה overexpressing גרסה מוטציה דומיננטית-שלילי של זה.
Abstract
דומיננטה-שלילי (DN) חלבון עיכוב היא שיטה חזקה לתמרן החלבון פונקציה, ומציע מספר יתרונות על גישות אחרות מבוסס גנום. לדוגמה, למרות chimeric ו- Cre-LoxP אסטרטגיות מיקוד היה בשימוש נרחב, המגבלות מהותי של אסטרטגיות אלו (קרי, פעילות קדם דולפים, ביטוי Cre פסיפס, וכו ‘) שיש באופן משמעותי מוגבלת שלהם יישום. יתר על כן, מחיקה מלאה של גנים רבים אנדוגני הוא embryonically קטלני, ואי אפשר ללמוד פונקציה ג’ין בחיים לאחר הלידה. לטפל באתגרים אלה, יש שינויים משמעותיים כדי פרוטוקול הנדסה גנטית מוקדמת ואנו בשילוב גרסה מקוצרת (הטרנסגניים) של הגן Rb1 פרוטאז lysosomal procathepsin B (CB), כדי ליצור מודל העכבר DN של Rb1 (CBRb). בשל נוכחותם של פרוטאז lysosomal, החלבון פיוז’ן CB-RB1 שלם ומורכב שמעצבת שלה מנותבות עבור בתיווך פרוטאוזום השפלה. יתר על כן, הנוכחות של יסוד משרן (rtTA) טטרציקלין הבונה הטרנסגניים מאפשר ויסות inducible והפיך החלבון RB1. הנוכחות של מקדם רוזה-חטיבתי בכל מקום במודל עכבר CBRb הופכת כלי שימושי כדי לבצע אבלציה ג’ין Rb1 ארעי והפיך ולספק חוקרים משאב להבנת פעילות שלה כמעט בכל סוג תא איפה בא לידי ביטוי RB1.
Introduction
רוב הגישות מכוון ablations גנים וחלבונים להסתמך על תהליכים קבועים, אשר בדרך כלל להוביל חיסול מוחלט או חיתוך של ג’ין, רצפי RNA או החלבון עניין (פוי). המטרה הכוללת של שיטה זו הוא מהנדס חלבון רקומביננטי לבטל את הפונקציה של אנדוגני, פראי-סוג חלבון. יש וביקרה ואנו בנגיעות של אסטרטגיה אלטרנטיבית1,2, מה שמאפשר עבור אבלציה זמני של נקודת משחק לחץ באמצעות עיכוב DN. שיטה זו פועלת multimeric וגם פפטידים monomeric אך היא המתאימה ביותר עבור חלבונים שפועלים בהרכבה multimeric.
השיטה מורכבת פיוזינג lysosomal פרוטאז CB יחידת משנה של multimeric פוי (CB פיוז’ן מורכבים). פיוז’ן CB תוצאות מורכבות יכול לקיים אינטראקציה עם proteolytically לעכל החלבון אנדוגני או להסיט את המתחם כולו CB-פוי ליזוזום להיות מפורק3. יתר על כן, שילוב של פיוז’ן CB מורכבים עם הטבע inducible של מערכת ההפעלה תעתיק שבשליטת טטרציקלין (TetO) מאפשר ביטוי inducible ומבוקר transgene ב אופנה הפיך2. למרות שימושי בנסיבות רבות, מחיקה מלאה של גנים או חלבונים ויוו יכול לגרום קטלני4,5,6. באופן דומה, מחיקה רקמות ספציפיות, מותנה של כמה גנים או חלבונים באמצעות מערכת Cre/סלומון לא יכול להיות ישירה, כמו, בסופו של דבר, תוביל לאובדן תמידי של אלמנטים קריטיים גנומית7. לפיכך, בהתאם ג’ין או פוי, וגם יהיה יעיל במתן מודל שימושי עבור מחקרים מאוחרים יותר, במיוחד של הגנים או של חלבונים פונקציונליים מחקרים בעכברים כמחנכת ומבוגרים מאוחר.
כדי לעקוף בעיות הקשורות גישות כאלה לספק הוכחה של עקרון על היעילות של השיטה המוצעת, בחרנו לבחון את השיטה המובאת כאן על ידי יצירת גירסה DN מותנה של החלבון 1 רטינובלסטומה (RB1). מספר אפשרויות להיות המוצע8,9,10 לבטל את הפונקציה של אנדוגני RB1; עם זאת, כולן בפני חלק מהמגבלות באותו שנדונו לעיל: germline קבוע מחיקה של RB1 embryonically קטלני, והוא, בקנה אחד עם תפקידו משתיק קול הגידול, קבע RB1 מחיקה מותנה שמוביל מגוון רחב של גידולים11. אף-על-פי גירסת DN RB1 לא נראה להתרחש באופן טבעי, חלופה טובה יותר האסטרטגיות הזמינות כעת צריך לאפשר איון חנותם מבוקרת של RB1 אנדוגני ולספק מנגנון חלופי לשחזור בסופו של דבר שלה פונקציה. בסיס כזה מבנה תוארה לפני למעלה משני עשורים1. עם זאת, בשל מגבלות טכנולוגיות, זה חסרה מנגנון הבקרה transgene ההפעלה, התגובה של רקמות ירידה לפרטים. מחקר זה הוא הראשון כדי לשלב את האלגנטיות דוקסילין (Dox)-תלוי תעתיק המערכת עם הבונה מהונדס מהונדס של חלבונים CB, Rb1 פרוטאז lysosomal. המודל העכבר CBRb המתקבל מאפשר RB1 בתיווך Dox מוסדר באופן זמני תקנה2. היתרון של שימוש כזה מבוסס פרוטאום בגישה ללמוד ג’ין פונקציה היא כי זה יכול להיות מאומץ עבור ג’ין בכל עניין, עם מידע מינימלי על פעילותה.
האסטרטגיה המוצעת DN transgene מציע יתרונות רבים על פני הגישות המסורתיות. ראשית, עיכוב חלבונים DN מוביל רק אבלציה חלקית בפעילות חלבון, וכך לשמר ביטוי אנדוגני שיורית. כזו כ”בלתי רצוי מאוד במצבים איפה חיסול מוחלט של פעילות החלבון מוביל lethality עובריים, במידה רבה להגביל חקירה כלשהי ללמוד ג’ין פונקציית עכבר חי. שנית, הנוכחות של מערכת TetO מאפשרת הפעלת transgene רק בנוכחות אנטיביוטיקה, מה שמאפשר עבור פקד יעיל של הפיכה של הפעילות transgene. לפיכך, על ידי חדל המינהל לאנטיביוטיקה, ניתן לבטל את הפעלתם את המערכת הטרנסגניים, ביטוי RB1 נורמלי הוא למקום. שלישית, יחודיות של הביטוי transgene יכול להשתנות בהתאם האמרגן של הבחירה. בעוד שבחרנו את המקדם רוזה-חטיבתי בכל מקום על הוכחה של עקרון, הצבת את transgene תחת מקדם רקמות ספציפיות סביר להגביל את הביטוי transgene לא רצויים וכדי להקל על מחקרים על היישום טיפולית של transgene הזה מתודולוגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לעקוף את המגבלות המשויך אסטרטגיות הטרנסגניים מסורתיים, חיפשנו לייצר דגם העכבר שבו פוי אנדוגני יכולה להיות מותנית מומת על ידי overexpressing צורה מוטציה DN של זה בצורה ייתכן. כדי לבטל את הפונקציה של POIs אנדוגני, היו מספר אפשרויות המוצע15,16,17. יש ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCS2 + CB-Myc6 וקטור הייתה מתנת הורביץ מרשל (אוניברסיטת וושינגטון, סיאטל, וושינגטון, ארה ב). התאים היי-OC1 נמסרו באדיבות בידי Fedrico Kalinec (גפן דוד בית ספר לרפואה, אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג’לס, קליפורניה, ארה). תמיכה טכנית סופק על ידי UNMC העכבר הגנום הנדסה הליבה (Gurumurthy רדיו אזרחי, דון פוגע, רולן הקואדרוס) והמתקן קרייטון אוניברסיטת משולב ביו הדמיה (ריצ’רד Hallworth, ג’ון Billheimer). הנדסה הגנום העכבר UNMC נתמכה על ידי פרס פיתוח מוסדיים (מושג) מ- NIH/NIGMS, להעניק מספר P20 GM103471. מתקן משולב הדמיה ביו נתמכה על ידי בית הספר אוניברסיטת קרייטון של רפואה ומענקים GM103427 ו- GM110768 מ NIH/NIGMS. המתקן נבנה עם תמיכה של מענקים של המרכז הארצי עבור משאבים למחקר (RR016469), את NIGMS (GM103427). הקווים עכבר הנוצר במחקר זה היו נשמרים במתקן משאבים בעלי חיים של אוניברסיטת קרייטון, תשתית אשר היה משופר באמצעות מענק על ידי NIH/NCRR G20RR024001. עבודה זו קיבלה בעבר תמיכה באמצעות של NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE להעניק (סמית ‘ ד שלי) NIH/orip ב R21OD019745-01A1 (S.M.R.-ס), של המתעוררים המחקר מענק של הקרן לבריאות שמיעה (ס’ טרנג). התוכן של המחקר הזה הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
Riferimenti
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Biologia dello sviluppo. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetica. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
