Inducible और प्रतिवर्ती प्रमुख-नकारात्मक (डीएन) प्रोटीन निषेध
Summary
यहां हम एक के लिए एक प्रमुख नकारात्मक inducible प्रणाली है, जिसमें किसी भी प्रोटीन सशर्त यह के एक प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती संस्करण व्यक्त reversibly द्वारा निष्क्रिय किया जा सकता है विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं ।
Abstract
प्रमुख-नकारात्मक (डीएन) प्रोटीन निषेध एक शक्तिशाली करने के लिए प्रोटीन समारोह में हेरफेर विधि है और अंय जीनोम पर कई लाभ प्रदान करता है आधारित दृष्टिकोण । उदाहरण के लिए, हालांकि chimeric और Cre-LoxP लक्ष्यीकरण रणनीतियों व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, इन रणनीतियों की आंतरिक सीमाओं (यानी, टपकाना प्रमोटर गतिविधि, मोज़ेक Cre अभिव्यक्ति, आदि) काफी प्रतिबंधित है उनके अनुप्रयोग. इसके अलावा, कई अंतर्जात जीन का एक पूरा विलोपन भ्रूण घातक है, यह असंभव जन्मोत्तर जीवन में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए बना । इन चुनौतियों का पता करने के लिए, हम एक प्रारंभिक आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण परिवर्तन किया है और एक lysosomal procathepsin (सीबी) के साथ Rb1 जीन के एक छोटे (ट्रांसजेनिक) संस्करण संयुक्त, Rb1 (CBRb) के एक DN माउस मॉडल उत्पंन करने के लिए । एक lysosomal की उपस्थिति के कारण, पूरे सीबी-RB1 फ्यूजन प्रोटीन और उसके बातचीत जटिल proteasome-मध्यस्थता क्षरण के लिए रूट कर रहे हैं । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक निर्माण में एक टेट्रासाइक्लिन उत्प्रेरण (rtTA) तत्व की उपस्थिति RB1 प्रोटीन के एक inducible और प्रतिवर्ती विनियमन सक्षम बनाता है । CBRb माउस मॉडल में एक सर्वव्यापी रोजा-सीएजी प्रमोटर की मौजूदगी यह क्षणिक और प्रतिवर्ती Rb1 जीन पृथक को बाहर निकालने के लिए एक उपयोगी उपकरण बनाती है और शोधकर्ताओं को वस्तुतः किसी भी कोशिका प्रकार में अपनी गतिविधि को समझने के लिए एक संसाधन प्रदान करती है जहां Rb1 व्यक्त किया जाता है ।
Introduction
सबसे जीन और प्रोटीन ablations पर लक्ष्य दृष्टिकोण स्थाई प्रक्रियाओं, जो आम तौर पर पूरा उन्मूलन या जीन, आरएनए दृश्यों, या ब्याज की प्रोटीन (POI) के जनचेतना के लिए नेतृत्व पर भरोसा करते हैं । इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए एक रिकॉमबिनेंट प्रोटीन इंजीनियर अंतर्जात, जंगली प्रकार के प्रोटीन के समारोह को समाप्त करने के लिए है । हम फिर से गौर किया है और एक वैकल्पिक रणनीति1,2, जो डीएन निषेध के माध्यम से एक POI के अस्थाई पृथक के लिए अनुमति देता है नया । इस विधि दोनों multimeric और monomeric पेप्टाइड्स के लिए काम करता है, लेकिन सबसे अच्छा प्रोटीन है कि एक multimeric विधानसभा में समारोह के लिए अनुकूल है ।
विधि एक multimeric POI (सीबी फ्यूजन परिसर) के एक उपइकाई को lysosomal को चिढ़ाने सीबी मना के होते हैं । परिणामी सीबी फ्यूजन परिसर के साथ बातचीत कर सकते हैं और proteolytically अंतर्जात प्रोटीन को पचाने या lysosome के लिए पूरे सीबी-POI जटिल हटाने के लिए3नीचा होना. इसके अलावा, टेट्रासाइक्लिन-नियंत्रित transcriptional सक्रियकरण (TetO) प्रणाली के inducible प्रकृति के साथ सीबी फ्यूजन परिसर का एक संयोजन एक inducible और एक प्रतिवर्ती फैशन2में transgene की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है । कई परिस्थितियों में उपयोगी हालांकि, vivo में जीन या प्रोटीन का पूरा विलोपन घातकता में परिणाम कर सकते हैं4,5,6. इसी तरह, ऊतक विशिष्ट, कुछ जीनों या Cre/लोक्स प्रणाली का उपयोग प्रोटीन का सशर्त विलोपन सीधा नहीं हो सकता है, के रूप में यह होगा, अंत में, महत्वपूर्ण जीनोमिक तत्वों की स्थायी हानि के लिए नेतृत्व7. इसलिए, जीन या POI पर निर्भर करता है, इन तरीकों की न तो बाद में अध्ययन, विशेष रूप से जीन ‘ या देर जन्मोत्तर और वयस्क चूहों में ‘ प्रोटीन कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल उपलब्ध कराने में प्रभावी हो जाएगा ।
इस तरह के दृष्टिकोण के साथ जुड़े समस्याओं को दरकिनार और प्रस्तावित विधि की प्रभावशीलता पर सबूत के सिद्धांत प्रदान करते हैं, हम Retinoblastoma 1 (RB1) प्रोटीन के एक सशर्त डीएन संस्करण पैदा करके यहां प्रस्तुत विधि का परीक्षण करने के लिए चुना है । अंतर्जात RB1 के कार्य को समाप्त करने के लिए कई विकल्प8,9,10 प्रस्तावित किए गए हैं; हालांकि, उन सभी के ऊपर चर्चा की ही सीमाओं में से कुछ का सामना करना पड़ा: RB1 के स्थाई germline विलोपन भ्रूण घातक है, और, अपने ट्यूमर शमन भूमिका के साथ संगत, स्थाई RB1 सशर्त विलोपन11ट्यूमर की एक किस्म की ओर जाता है । हालांकि RB1 के एक डीएन संस्करण स्वाभाविक रूप से घटित नहीं लगता है, वर्तमान में उपलब्ध रणनीतियों के लिए एक बेहतर विकल्प अंतर्जात RB1 की एक अस्थाई नियंत्रित निष्क्रियता के लिए अनुमति चाहिए और एक वैकल्पिक व्यवस्था प्रदान करने के लिए अंततः अपने बहाल समारोह. इस तरह के एक निर्माण के लिए आधार पर दो दशक पहले1वर्णित किया गया था । हालांकि, तकनीकी सीमाओं के कारण, यह transgene सक्रियण, प्रतिक्रिया, और ऊतक विशिष्टता को नियंत्रित करने के लिए एक तंत्र का अभाव है । इस अध्ययन के doxycycline (Dox) के लालित्य गठबंधन करने के लिए पहली है एक इंजीनियर ट्रांसजेनिक lysosomal के निर्माण के साथ निर्भर transcriptional प्रणाली को छेड़ो सीबी और Rb1 प्रोटीन । परिणामस्वरूप CBRb माउस मॉडल एक अस्थाई रूप से विनियमित Dox-मध्यस्थता RB1 विनियमन2के लिए अनुमति देता है । जीन फंक्शन का अध्ययन करने के लिए इस तरह के एक proteome आधारित दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह ब्याज की किसी भी जीन के लिए अपनाया जा सकता है, अपनी गतिविधि के बारे में न्यूनतम जानकारी के साथ.
प्रस्तावित डीएन transgene रणनीति पारंपरिक दृष्टिकोण पर कई लाभ प्रदान करता है । सबसे पहले, डीएन प्रोटीन निषेध प्रोटीन गतिविधि में केवल एक आंशिक पृथक की ओर जाता है, इस प्रकार एक अवशिष्ट अंतर्जात अभिव्यक्ति के संरक्षण । इस तरह के एक परिणाम उच्च स्थितियों में वांछनीय है जहां प्रोटीन गतिविधि का एक पूरा उंमूलन भ्रूण मृत्यु की ओर जाता है, बहुत किसी भी जांच सीमित करने के लिए एक जीवित माउस में जीन समारोह का अध्ययन । दूसरा, TetO प्रणाली की उपस्थिति केवल एक एंटीबायोटिक है, जो transgene गतिविधि के एक कुशल और प्रतिवर्ती नियंत्रण के लिए अनुमति देता है की उपस्थिति में transgene सक्रियण सक्षम बनाता है । इस प्रकार, एंटीबायोटिक प्रशासन को बंद करके, ट्रांसजेनिक प्रणाली निष्क्रिय किया जा सकता है, और एक सामांय RB1 अभिव्यक्ति जगह में वापस आ गया है । तीसरा, transgene अभिव्यक्ति की विशिष्टता पसंद के प्रमोटर के आधार पर भिंन हो सकते हैं । जब तक हमने सबूत के सिद्धांत के लिए सर्वव्यापी रोजा-सीएजी प्रमोटर चुना है, transgene को ऊतक-विशिष्ट प्रवर्तक के तहत रखकर अवांछित transgene अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करने और इस transgene के चिकित्सीय अनुप्रयोग पर अध्ययन की सुविधा देने की संभावना है । पद्धति.
Protocol
Representative Results
Discussion
पारंपरिक ट्रांसजेनिक रणनीतियों के साथ जुड़े सीमाओं को दरकिनार, हम एक माउस मॉडल जिसमें एक अंतर्जात POI सशर्त एक spatiotemporal तरीके से यह की एक डीएन उत्परिवर्ती फार्म व्यक्त द्वारा निष्क्रिय किया जा सकता है उत्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pCS2 + सीबी-Myc6 वेक्टर मार्शल Horwitz (वाशिंगटन, सिएटल, WA, संयुक्त राज्य अमेरिका के विश्वविद्यालय) से एक उपहार था । ऊँ-OC1 कोशिकाओं को Fedrico Kalinec (डेविड Geffen स्कूल ऑफ मेडिसिन, UCLA, लॉस एंजिल्स, CA, यूएसए) द्वारा प्रदान किया गया था । तकनीकी सहायता UNMC माउस जीनोम इंजीनियरिंग कोर (C.B. गुरुमूर्ति, डॉन दूसर, रोलेन Quadros) और ट्विटर विश्वविद्यालय एकीकृत जैव चिकित्सा इमेजिंग सुविधा (रिचर्ड Hallworth, जॉन Billheimer) द्वारा प्रदान किया गया था । UNMC माउस जीनोम इंजीनियरिंग NIH/NIGMS, अनुदान संख्या P20 GM103471 से एक संस्थागत विकास पुरस्कार (आइडिया) द्वारा समर्थित किया गया था । एकीकृत बायोमेडिकल इमेजिंग सुविधा का समर्थन ट्विटर विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन और पलाश GM103427 और GM110768 से NIGMS NIH/ इस सुविधा का निर्माण नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च रिसोर्स (RR016469) और NIGMS (GM103427) से अनुदान से समर्थन के साथ किया गया था । इस अध्ययन में उत्पंन माउस लाइनों ट्विटर विश्वविद्यालय के पशु संसाधन सुविधा, जिसका बुनियादी ढांचा NIH/NCRR G20RR024001 द्वारा एक अनुदान के माध्यम से सुधार किया गया था पर बनाए रखा गया था । यह काम एक NIH के माध्यम से पिछले समर्थन प्राप्त/NCRR 5P20RR018788-/NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE अनुदान (शेली डी स्मिथ को), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-एस.), और एक उभरती अनुसंधान अनुदान सुनवाई स्वास्थ्य फाउंडेशन से (एस जलतरंग) । इस शोध की सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
Riferimenti
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