Inibizione della proteina viscoelastica e reversibile dominante-negativo (DN)
Summary
Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di un sistema inducibile dominante-negativo, in cui tutta la proteina può essere inattivata in modo condizionale reversibilmente overexpressing una versione mutante dominante-negativo di esso.
Abstract
Inibizione della proteina di dominante-negativo (DN) è un metodo potente per manipolare la funzione della proteina e offre parecchi vantaggi sopra altri approcci basati sul genoma. Ad esempio, sebbene chimerici e Cre-LoxP strategie di targeting sono stati ampiamente utilizzate, le limitazioni intrinseche di queste strategie (cioè, l’attività del promotore che perde, espressione di Cre mosaico, ecc.) sono significativamente limitati loro applicazione. Inoltre, un’omissione completa di molti geni endogeni è embrionalmente letale, rendendo impossibile per studiare la funzione del gene nella vita postnatale. Per affrontare queste sfide, abbiamo apportato modifiche significative a un protocollo iniziale di ingegneria genetica e combinato una versione breve (transgenica) del gene Rb1 con una proteasi lisosomica procathepsin B (CB), per generare un modello murino di DN di Rb1 (CBRb). A causa della presenza di una proteasi lisosomiale, la proteina di fusione CB-RB1 intera e il suo complesso interagente vengono instradati per degradazione proteasome-mediata. Inoltre, la presenza di un elemento di induttore (rtTA) tetraciclina nel costrutto transgenico consente una regolazione viscoelastica e reversibile della proteina RB1. La presenza di un promotore di ROSA-CAG onnipresente nel modello del topo CBRb lo rende uno strumento utile per eseguire l’ablazione gene Rb1 transitorio e reversibile e fornire ai ricercatori una risorsa per comprendere la sua attività in praticamente qualsiasi tipo di cellula dove RB1 è espresso.
Introduction
Maggior parte degli approcci puntando le ablazioni di gene e la proteina si basano su processi permanenti, che generalmente conducono alla completa eliminazione o troncamento del gene, sequenze di RNA o proteine di interesse (PDI). L’obiettivo generale di questo metodo è quello di progettare una proteina ricombinante per abolire la funzione della proteina endogena, selvaggio-tipo. Abbiamo rivisitato e rinnovato una strategia alternativa1,2, che permette per l’ablazione temporanea di un PDI tramite inibizione di DN. Questo metodo funziona per multimerici e peptidi monomerici ma è più adatto per proteine che funzionano in un assembly multimerica.
Il metodo consiste di fondere la proteasi lisosomica CB per una subunità di un multimerico PDI (fusione di CB complessi). La risultante fusione CB complessa possa interagire con e proteoliticamente digerire la proteina endogena o deviare l’intero complesso di CB-POI per i lisosomi per essere degradati3. Inoltre, una combinazione di fusione CB complessa con la natura viscoelastica del sistema controllato tetraciclina attivazione trascrizionale (TetO) permette un’espressione inducibile e controllata del transgene in un modo reversibile2. Anche se utile in molte circostanze, l’eliminazione completa dei geni o proteine in vivo può provocare mortalità4,5,6. Allo stesso modo, tessuto-specifici, condizionale cancellazione di alcuni geni o proteine utilizzando il sistema Cre/Lox potrebbe non essere semplice, come, in definitiva, porterà alla perdita permanente di elementi critici genomico7. Pertanto, a seconda del gene o POI, nessuno di questi approcci sarà efficace nel fornire un utile modello per studi successivi, particolarmente dei geni o proteine studi funzionali in topi ritardo postnatali e adulti.
Per aggirare i problemi connessi con questo tipo di approccio e di fornire prova di principio sull’efficacia del metodo proposto, abbiamo scelto di testare il metodo presentato qui generando una versione di DN condizionale della proteina 1 di Retinoblastoma (RB1). Diverse opzioni sono state proposte8,9,10 per abolire la funzione di RB1 endogeno; Tuttavia, tutti loro ha affrontato alcune delle stesse limitazioni discusse sopra: l’eliminazione permanente di germline di RB1 è embrionalmente letale, e coerente con il suo ruolo di soppressore del tumore, permanente eliminazione condizionale RB1 porta a una varietà di tumori11. Anche se una versione di DN di RB1 non sembra verificarsi naturalmente, un’alternativa migliore alle strategie attualmente disponibili dovrebbe consentire un’inattivazione temporaneamente controllata di RB1 endogeno e fornire un meccanismo alternativo per ripristinare alla fine suo funzione. La base per tale costrutto è stato descritto più di due decenni fa1. Tuttavia, a causa di limiti tecnologici, mancava un meccanismo di attivazione del controllo del transgene, risposta e specificità tissutale. Questo studio è il primo a combinare l’eleganza di doxiciclina (Dox)-sistema trascrizionale dipendente con un costrutto transgenico ingegnerizzato di proteine di proteasi lisosomica CB e Rb1 . Il modello di mouse CBRb risultante permette per un temporaneamente regolamentato RB1 Dox-mediata regola2. Il vantaggio dell’utilizzo di tali un approccio basato sul proteoma per studiare la funzione del gene è che possa essere adottata per ogni gene di interesse, con informazioni minime sulla sua attività.
La strategia proposta del transgene DN offre molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali. In primo luogo, l’inibizione della proteina di DN conduce a solo un’ablazione parziale attività proteica, preservando in tal modo un’espressione endogena residua. Tale risultato è altamente desiderabile in situazioni dove un’eliminazione completa dell’attività della proteina conduce alla mortalità embrionale, limitando notevolmente qualsiasi indagine per studiare la funzione del gene in un mouse dal vivo. In secondo luogo, la presenza del sistema TetO consente l’attivazione di transgene solo in presenza di un antibiotico, che consente un controllo efficace e reversibile dell’attività del transgene. Così, cessando la somministrazione di antibiotici, il sistema transgenico può essere disattivato, e una normale espressione di RB1 è tornato a posto. In terzo luogo, la specificità dell’espressione del transgene può variare secondo il promotore della scelta. Mentre abbiamo scelto il promotore di ROSA-CAG onnipresente per prova-de-principio, ponendo il transgene sotto un promotore tessuto-specifico rischia di limitare l’espressione del transgene indesiderati e facilitare gli studi sull’applicazione terapeutica di questo transgene metodologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per aggirare le limitazioni associate tradizionali strategie transgeniche, abbiamo cercato di generare un modello di topo in cui un PDI endogeno può essere inattivato in modo condizionale overexpressing una forma mutante di DN di esso in maniera spatiotemporal. Per abolire la funzione di PDI endogeni, diverse opzioni sono state proposte15,16,17. Abbiamo modificato un precedente strategia genetica1 combin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il pCS2 + CB-Myc6 vettore era un regalo da Marshall Horwitz (Università di Washington, Seattle, WA, USA). Le cellule di HEI-OC1 sono state gentilmente concesse da Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Supporto tecnico è stato fornito dal genoma di Mouse UNMC Core Engineering (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) e la Creighton University Integrated Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). La UNMC Mouse Genome ingegneria è stata sostenuta da un premio per lo sviluppo istituzionale (IDea) da NIH/NIGMS, concedere numero P20 GM103471. L’Integrated Facility di Imaging biomedico è stato sostenuto dalla Creighton University School di medicina e sovvenzioni, GM103427 e GM110768 da NIH/NIGMS. L’impianto è stato costruito con il sostegno di sovvenzioni dal centro nazionale per le risorse di ricerca (RR016469) e NIGMS (GM103427). Le linee del mouse generate in questo studio sono state mantenute a animale Resource Facility di Creighton University, cui infrastruttura è stata migliorata attraverso una sovvenzione di NIH/NCRR G20RR024001. Questo lavoro ha ricevuto oltre supporto attraverso un NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE concedere (a Shelley D. Smith), NIH/IP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) e un emergente research grant della Fondazione di salute dell’udito (a S. Marco). Il contenuto di questa ricerca è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
Riferimenti
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