Ингибирование белков индуцибельной и обратимым Доминант отрицательной (DN)
Summary
Здесь мы представляем протокол развивать систему индуцибельной Доминант отрицательных, в котором любой белок может быть условно инактивированная обратимо экспрессирующих черепашки версии Доминант отрицательные.
Abstract
Доминант отрицательные (DN) белок является мощный способ манипулировать функции протеина и предлагает несколько преимуществ над другими подходы, основанные на геном. Например хотя химерных и Cre-LoxP ориентации стратегий широко использовались, встроенные ограничения этих стратегий (т.е., протекающая промоутер активность, мозаика Cre выражения и т.д.) значительно ограничили их приложения. Кроме того полное исключение много эндогенные генов embryonically смертельной, что делает невозможным для изучения функции гена в послеродовой период жизни. Для решения этих проблем, мы внесли значительные изменения в начале протокол генной инженерии и короткая (трансгенных) версия Rb1 гена в сочетании с лизосомальных протеазы procathepsin B (CB), чтобы создать модель мыши DN Rb1 (НАСВВП). Благодаря наличию лизосомальных протеазы весь CB-RB1 синтез белка и его взаимодействующих комплекса маршрутизируются протеасом опосредованной деградации. Кроме того присутствие элемента индуктором (rtTA) тетрациклина в трансгенных конструкция позволяет индуцибельной и обратимым регулирование RB1 белка. Наличие повсеместно Роза-CAG промоутер в мышиной модели НАСВВП делает его полезным инструментом для выполнения переходных и обратимым Rb1 гена абляции и исследователи ресурс для понимания ее деятельности в практически любой тип клеток, где выражается RB1.
Introduction
Большинство подходов, направленных на генов и белков аблаций полагаются на постоянные процессы, которые обычно приводят к полной ликвидации или усечение гена, РНК последовательности или протеин интереса (POI). Общая цель этого метода является инженер рекомбинантных белков отменить функцию эндогенные, одичал тип протеина. У нас пересмотреть и обновленный альтернативная стратегия1,2, который позволяет для временного абляции POI через ингибитирование DN. Этот метод работает для multimeric и мономерных пептидов, но лучше всего подходит для белков, которые функционируют в сборке multimeric.
Этот метод состоит из фьюзинга лизосомальных протеазы CB для субблока multimeric Пои (CB фьюжн комплекс). Результирующая CB фьюжн комплекс может взаимодействовать с и proteolytically дайджест эндогенного белка или отвлекать весь комплекс CB-Пои для Лизосома деградированных3. Кроме того сочетание CB фьюжн комплекс с индуцибельной характер системы контролируемой тетрациклин transcriptional активации (Тето) позволяет выражение индуцибельной и контролируемых трансген в реверсивные мода2. Хотя полезно во многих случаях, полное исключение генов или белков в естественных условиях может привести к летальность4,5,6. Аналогичным образом ткани конкретным, условного удаления некоторых генов или белки, с использованием системы Cre/Lox не может быть простым, как это в конечном счете, приведет к постоянной потере критических геномной элементы7. Таким образом, в зависимости от гена или POI, ни один из этих подходов будет эффективным в предоставлении полезной моделью для последующих исследований, особенно генов или белки функциональных исследований в конце послеродового и взрослых мышей.
Чтобы обойти проблемы, связанные с такими подходами и обеспечить доказательство принципа эффективности предложенного метода, мы выбрали для тестирования метода, представленные здесь, создавая условный DN версию белка ретинобластомы 1 (RB1). Несколько вариантов были предлагаемые8,9,10 отменить функцию эндогенного RB1; Однако, все они сталкиваются некоторые из те же ограничения, обсуждавшиеся выше: исключить постоянное микрофлорой RB1 embryonically смертельной, и, в соответствии с его опухоль подавитель роль, постоянного RB1 условного удаления приводит к различных опухолей11. Даже несмотря на то, что версия DN RB1, как представляется, не происходят естественно, лучшей альтернативы для имеющихся в настоящее время стратегии позволяют временно контролируемых инактивации эндогенного RB1 и предоставить альтернативный механизм в конечном итоге восстановить ее функция. Основой для такой конструкции был описан более двух десятилетий назад1. Однако из-за технологических ограничений, это не механизм для активации управления трансген, ответ и специфика ткани. Это исследование является первым, чтобы совместить элегантность доксициклин (Dox)-зависимых транскрипционный анализ системы с конструкцией инженерии трансгенных лизосомальных протеазы CB и Rb1 белков. Полученная в результате модель мыши НАСВВП позволяет временно регулируемых Dox опосредованной RB1 правила2. Преимущество использования такого подхода, основанного на протеома для изучения функции гена является, что он может быть принят для любого гена интереса, с минимальной информации о своей деятельности.
Предлагаемая стратегия трансген DN имеет много преимуществ над традиционными подходами. Во-первых DN белка ингибирование приводит к только частичное абляции активности белка, таким образом, сохраняя остаточного эндогенного выражение. Такой результат является весьма желательным в ситуациях, где полная ликвидация деятельности белка приводит к эмбриональной летальность, значительно ограничивает любое расследование для изучения функции гена в живой мыши. Во-вторых наличие системы Тето позволяет трансген активации только в присутствии антибиотик, который позволяет для эффективной и обратимым контроль деятельности трансген. Таким образом путем прекращения антибиотиков, трансгенных система может быть отключена, и нормальное выражение RB1 обратно на место. В-третьих специфика трансген выражение может варьироваться в зависимости от промоутера выбора. В то время как мы выбрали вездесущие Роза-CAG промоутер для доказательства в принципе, поместив трансген под ткани конкретной промоутера, скорее всего ограничить нежелательные трансген выражение и облегчения исследования терапевтического применения этой трансген методология.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы обойти ограничения, связанные с традиционными трансгенных стратегии, мы стремились создать модель мыши, в котором эндогенного POI могут быть условно инактивированная экспрессирующих DN мутантные формы его на основе пространственно-временных. Чтобы отменить функцию эндогенного POI…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCS2 + CB-Myc6 вектор был подарок от Хорвитц Маршалл (Вашингтонский университет, Сиэтл, Вашингтон, США). ХЕЙ-OC1 клетки были любезно предоставлены Fedrico Kalinec (Дэвид Геффен школа медицины, Калифорнийского университета, Лос-Анджелес, Калифорния, США). Техническая поддержка была оказана UNMC мыши генома инженерных ядро (К.Б. Gurumurthy, Дон Хармс, Rolen Quadros) и Крейтон университета комплексной биомедицинских изображений объекта (Richard Hallworth, Джон Billheimer). UNMC мыши генома инженерных была поддержана институционального развития Award (IDea) от NIH/NIGMS, предоставьте номер P20 GM103471. Интегрированный биомедицинских изображений объекта было поддержано Крейтон университета Школа медицины и грантов, GM103427 и GM110768 от NIH/NIGMS. Объект был построен при поддержке грантов от национального центра для исследования ресурсов (RR016469) и NIGMS (GM103427). Мыши линии, созданные в этом исследовании были сохранены на Крейтон университета животных ресурсов Фонда, инфраструктура которой была улучшена посредством гранта NIH/NCRR G20RR024001. Эта работа получила в прошлом поддержка через низ/NCRR 5P20RR018788-/ низ/NIGMS 8P20GM103471 КОБРЕ предоставить (Shelley д. Смит), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (Ш.М.Р-S.) и возникающих исследовательский грант от фонда здравоохранения слушания (для S. таранг). Содержание этого исследования является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
Riferimenti
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Biologia dello sviluppo. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetica. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
