Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)
Summary
Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema inducible negativo dominante, en el que cualquier proteína puede ser condicional inactivada por overexpressing reversiblemente una versión mutante dominante negativo de él.
Abstract
Dominante negativa inhibición de la proteína (DN) es un método potente para manipular la función de la proteína y ofrece varias ventajas sobre otros enfoques basados en el genoma. Por ejemplo, aunque quimérica y Cre-LoxP estrategias objetivos han sido ampliamente utilizados, las limitaciones intrínsecas de estas estrategias (es decir, actividad de promotor agujereado, expresión del Cre de mosaico, etc.) han restringido significativamente su aplicación. Por otra parte, una canceladura completa de numerosos genes endógenos es catequizador letal, lo que hace imposible para el estudio de funciones de los genes en la vida postnatal. Para enfrentar estos desafíos, hemos hecho cambios significativos a un protocolo de ingeniería genética temprana y combina una versión corta (transgénica) del gen Rb1 con una proteasa lysosomal B procathepsin (CB), para generar un modelo de ratón de DN de Rb1 (CBRb). Debido a la presencia de una proteasa lisosomal, la proteína de la fusión completa de CB-RB1 y su complejo de interacción se dirigen para la degradación mediada por el proteasoma. Por otra parte, la presencia de un elemento inductor (rtTA) de tetraciclina en la construcción de transgénico permite una regulación inducible y reversible de la proteína de RB1. La presencia de un promotor de ROSA-CAG omnipresente en el modelo de ratón de CBRb es una herramienta útil para realizar ablación de gene Rb1 transitoria y reversible y proporcionar a los investigadores un recurso para comprender su actividad en prácticamente cualquier tipo de célula donde se expresa el RB1.
Introduction
Enfoques más con el objetivo de la ablación del gen y la proteína dependen de procesos permanentes, que generalmente conducen a la eliminación completa o el truncamiento de la gene, secuencias de ARN o proteínas de interés (POI). El objetivo general de este método es diseñar una proteína recombinante para suprimir la función de la proteína endógena, tipo salvaje. Hemos revisado y renovado una estrategia alternativa1,2, que permite la ablación temporal de un POI a través de la inhibición de la DN. Este método funciona para multiméricas y péptidos monoméricos pero es el más adecuado para las proteínas que funcionan en una Asamblea de multimérica.
El método consiste en fundir la proteasa lisosomal CB a una subunidad de un multimérica POI (complejo de fusión de la CB). La fusión resultante de CB complejo puede interactuar con proteolytically digerir la proteína endógena y desviar todo el complejo de POI CB al lisosoma para ser degradados3. Por otra parte, una combinación de la fusión de CB compleja con el carácter inducible del sistema de activación transcripcional controlado por tetraciclina (TetO) permite una expresión inducible y controlada del transgén en una manera reversible2. Aunque útil en muchas circunstancias, la supresión completa de genes o proteínas in vivo puede resultar en mortalidad4,5,6. Además, eliminación de tejidos específicos, condicional de algunos genes o proteínas mediante el sistema Cre/Lox puede no ser sencillo, ya que provocaría, en última instancia, a la pérdida permanente de elementos genómicos críticos7. Por lo tanto, dependiendo de la genética o POI, ninguno de estos enfoques será eficaz en proporcionar un modelo útil para estudios posteriores, particularmente genes o proteínas los estudios funcionales en ratones adultos y postnatales tardíos.
Para eludir los problemas asociados con estos enfoques y proporcionar prueba de principio sobre la efectividad del método propuesto, hemos optado por probar el método presentado aquí por generar una versión DN condicional de la proteína Retinoblastoma 1 (RB1). Varias opciones han sido propuestos8,9,10 para suprimir la función de RB1 endógeno; sin embargo, todos ellos frente a algunas de las mismas limitaciones mencionadas: eliminación permanente del germline de RB1 es catequizador letal y, coherente con su función de supresor de tumor, permanente borrado condicional RB1 conduce a una variedad de tumores11. Aunque una versión de DN de RB1 parece no ocurre naturalmente, una mejor alternativa a las estrategias actualmente disponibles debe permitir una inactivación temporal controlada de RB1 endógeno y proporcionar un mecanismo alternativo para finalmente restaurar su función. La base para dicha construcción fue descrita hace más de dos décadas1. Sin embargo, debido a limitaciones tecnológicas, carecía de un mecanismo de control transgen activación, la respuesta y la especificidad de tejido. Este estudio es el primero en combinar la elegancia de la doxiciclina (Dox)-sistema transcripcional dependiente con una construcción transgénica ingeniería de proteínas de CB y Rb1 proteasa lisosomal. El modelo de ratón de CBRb resultante permite una RB1 mediada por Dox temporalmente regulada regulación2. La ventaja de utilizar un enfoque basado en el proteoma para estudiar la función genética es que puede adoptarse para cualquier gen de interés, con la mínima información sobre su actividad.
La estrategia propuesta de transgen DN ofrece muchas ventajas sobre los enfoques tradicionales. En primer lugar, inhibición de la proteína DN conduce a solamente una ablación parcial en actividad de la proteína, preservando así una expresión endógena residual. Ese resultado es muy conveniente en situaciones donde una eliminación completa de la actividad de la proteína conduce a mortalidad embrionaria, limitando grandemente cualquier investigación para estudiar la función del gen en un ratón vivo. En segundo lugar, la presencia del sistema TetO permite activación de transgen sólo en presencia de un antibiótico, que permite un control eficaz y reversible de la actividad del transgen. Así, al dejar la administración de antibióticos, se puede desactivar el sistema de transgénico, y es una expresión normal de RB1 en lugar. En tercer lugar, la especificidad de la expresión del transgen puede variar según el promotor de la opción. Aunque hemos optado por el promotor de ROSA-CAG ubicuo para la prueba de principio, colocar el transgén en un promotor tejido específico es probable restringir la expresión del transgén no deseados y facilitar estudios sobre la aplicación terapéutica de este transgén metodología.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para eludir las limitaciones asociadas con las estrategias tradicionales de transgénicas, se buscó generar un modelo de ratón en el que un POI endógena puede ser condicional inactivado por overexpressing una forma mutante de DN de él de manera espacio-temporal. Para suprimir la función de POIs endógenos, varias opciones han sido propuestos15,16,17. Hemos modificado una estrategia genética anterior1</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La pCS2 + CB-Myc6 vector fue un regalo de Marshall Horwitz (Universidad de Washington, Seattle, WA, USA). Las células de HEI-OC1 fueron amablemente proporcionadas por Fedrico Kalinec (escuela de medicina David Geffen, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Asistencia técnica fue proporcionada por la UNMC ratón genoma ingeniería base (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) y la Creighton University biomédica imagen instalación integrada (Richard Hallworth, John Billheimer). La UNMC ratón genoma Ingeniería fue apoyada por una concesión de desarrollo institucional (IDea) de los NIH/NIGMS, concesión número GM103471 P20. La instalación de imagen biomédica integrada fue apoyada por la Universidad de Creighton de la medicina y becas GM103427 y GM110768 de NIH/NIGMS. La instalación fue construida con el apoyo de becas del centro nacional para recursos de investigación (RR016469) y el NIGMS (GM103427). Las líneas de ratón generadas en este estudio fueron mantenidas en instalaciones de recursos Animal de la Universidad de Creighton, cuya infraestructura fue mejorada a través de una subvención por NIH/NCRR G20RR024001. Este trabajo recibida más allá del apoyo a través de un NIH/NCRR 5P20RR018788 – NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE conceder (a Shelley D. Smith), NIH/D.I.I.P R21OD019745-01A1 (s. S.) y una beca de investigación emergente de la Fundación de salud auditiva (para S. Tarang). El contenido de esta investigación es únicamente responsabilidad de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
Riferimenti
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