Inducerbara och reversibel Dominant-negativ (DN) Protein hämning
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utveckla en dominant-negativ inducerbara system, där något protein villkorligt kan inaktiveras genom att reversibelt överuttryck av en dominant-negativ mutant version av den.
Abstract
Dominant-negativ (DN) protein hämning är en kraftfull metod att manipulera proteinfunktion och erbjuder flera fördelar jämfört med andra tillvägagångssätt genomet. Till exempel även om chimär och Cre-LoxP inriktning strategier har använts i stor utsträckning, de inneboende begränsningarna av dessa strategier (dvs, läckande arrangören aktivitet, mosaik Cre uttryck, etc.) har avsevärt begränsat deras ansökan. Ett fullständigt borttagande av många endogena gener är dessutom embryonically dödliga, vilket gör det omöjligt att studera geners funktion i postnatal liv. För att möta dessa utmaningar, vi har gjort betydande ändringar i en tidig genteknik-protokoll och en kort (transgena) version av genen Rb1 i kombination med ett lysosomalt proteas procathepsin B (CB), att generera en DN musmodell av Rb1 (CBRb). På grund av närvaron av ett lysosomalt proteas dirigeras hela CB-RB1 fusion proteinet och dess samverkande komplex för proteasom-medierad nedbrytning. Dessutom kan förekomsten av en tetracyklin inducerare (rtTA) element i den transgena bygga en inducerbara och reversibel förordning av proteinet RB1. Förekomsten av en allestädes närvarande ROSA-CAG-arrangören i CBRb musmodell gör det ett användbart verktyg att utföra övergående och reversibla Rb1 gen ablation och ge forskarna en resurs för att förstå dess aktivitet i praktiskt taget alla celltyp där RB1 uttrycks.
Introduction
De flesta metoder syftar de genen och protein ablationerna förlita sig på permanenta processer, som i allmänhet leder till fullständig eliminering eller trunkering av genen, RNA sekvenser eller protein av intresse (POI). Det övergripande målet med denna metod är att konstruera ett rekombinant protein för att avskaffa funktionen av endogena, vildtyps-protein. Vi har revisited och fräschas en alternativ strategi1,2, som tillåter tillfälliga ablation av en INTRESSEPUNKT genom DN hämning. Denna metod fungerar för både multimeric och monomer peptider men passar bäst för proteiner som fungerar i en multimeric församling.
Metoden består av fusing de lysosomala proteasen CB till en del av en multimeric POI (CB fusion komplexa). Den resulterande CB fusionen komplexa kan interagera med och proteolytically smälta det kroppsegna proteinet eller avleda CB-POI hela komplexet till Lysosomen vara försämrade3. Dessutom möjliggör en kombination av CB fusion komplex med tetracyklin-kontrollerade transkriptionell (TetO) aktiveringssystemet inducerbara natur inducerbara och kontrollerad uttryck för transgenens i en reversibel mode2. Även om det är användbart i många fall, kan komplett borttagning av gener eller proteiner i vivo resultera i dödlighet4,5,6. Jämväl, vävnadsspecifika, villkorligt borttagande av vissa gener eller proteiner som använder Cre/Lox systemet kanske inte okomplicerad, eftersom det kommer i slutändan leda till permanent förlust av kritiska genomisk elements7. Därför beroende på genen eller POI, ingen av dessa metoder kommer att vara effektiva i att tillhandahålla en användbar modell för senare studier, särskilt gener eller proteiner funktionella studier i sen födsel och vuxna möss.
För att kringgå problemen i samband med sådana metoder och ge proof-of-principle på effektiviteten av den föreslagna metoden, har vi valt att testa metoden presenteras här genom att generera en villkorlig DN version av retinoblastom 1 (RB1) protein. Flera alternativ har varit föreslagna8,9,10 att avskaffa funktionen av endogena RB1; men alla av dem inför några av de samma begränsningar som diskuteras ovan: permanent könsceller radering av RB1 är embryonically dödliga, och konsekvent med sin tumör suppressor roll, permanent RB1 villkorlig borttagning leder till en mängd olika tumörer11. Även om en DN version av RB1 inte verkar förekomma naturligt, ett bättre alternativ till de för närvarande tillgängliga strategierna bör möjliggöra en temporally kontrollerade inaktivering av den endogena RB1 och ge en alternativ mekanism så småningom återställa dess funktion. Grunden för en sådan konstruktion beskrevs över två decennier sedan1. Men på grund av tekniska begränsningar saknade det en mekanism för att kontroll transgenens aktivering, svar och vävnadsspecificitet. Denna studie är först som kombinerar elegansen i doxycyklin (Dox)-beroende transkriptionell system med en konstruerade transgena konstruktion av lysosomala proteas CB och Rb1 proteiner. Den resulterande CBRb musmodellen möjliggör en tillfälligt reglerade Dox-medierad RB1 förordning2. Fördelen med att använda en sådan proteom-baserade strategi för att studera geners funktion är att det kan antas för någon gen av intresse, med minimal information om sin verksamhet.
Den föreslagna DN transgenens strategin erbjuder många fördelar jämfört med traditionella metoder. Först leder DN protein hämning till endast en partiell ablation i proteinaktiviteten, därmed bevara ett kvarvarande endogen uttryck. Ett sådant resultat är önskvärt i situationer där en fullständig eliminering av proteinaktiviteten leder till embryonal dödlighet, kraftigt begränsa någon undersökning för att studera geners funktion i en levande mus. Andra, förekomsten av TetO systemet möjliggör transgenens aktiveringen endast i närvaro av ett antibiotikum, som möjliggör en effektiv och reversibel kontroll av transgenens aktiviteten. Således, av uppehåll antibiotikumet administrering, transgena systemet kan inaktiveras, och en normal RB1-uttryck är tillbaka på plats. För det tredje, specificiteten av transgenens uttryck kan variera beroende på arrangören av val. Medan vi har valt den allestädes närvarande ROSA-CAG promotorn för proof-of-principle, kommer placera transgenens under en vävnad-specifika promotorn sannolikt att begränsa oönskade transgenens uttryck och underlätta studier om terapeutiska tillämpningen av denna transgenens metodik.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att kringgå de begränsningar som är associerade med traditionella transgena strategier, försökte vi generera en musmodell där en endogen POI villkorligt kan inaktiveras genom överuttryck en DN muterade formen av det på en spatiotemporal sätt. För att avskaffa funktionen av endogena intressepunkter, har flera alternativ varit föreslagna15,16,17. Vi har ändrat en tidigare genetiska strategi1</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den pCS2 + CB-Myc6 vector var en gåva från Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). HEI-OC1 cellerna var vänligen tillhandahållen av Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Tekniskt stöd tillhandahölls av UNMC mus genomet Engineering kärnan (C.B. Carstens, Don Harms, Rolen Quadros) och Creighton University integrerad biomedicinsk Imaging anläggningen (Richard Hallworth, John Billheimer). I UNMC mus genomet Engineering stöddes av en institutionell utveckling Award (IDea) från NIH/NIGMS, bevilja nummer P20 GM103471. Integrerad biomedicinsk Imaging anläggningen stöddes av den Creighton University School of Medicine och bidrag GM103427 och GM110768 från den NIH/NIGMS. Anläggningen byggdes med stöd från bidrag från nationellt centrum för forskningsresurser (RR016469) och NIGMS (GM103427). Mus raderna genereras i denna studie kvarstod vid Creighton University’s Animal resurs anläggning, vars infrastruktur förbättrades genom ett bidrag av NIH/NCRR G20RR024001. Detta arbete fick förbi stöd genom en NIH/NCRR 5P20RR018788 – NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE bevilja (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) och en framväxande forskningsanslag från stiftelsen förhandlingen hälsa (till S. Tarang). Innehållet i denna forskning är enbart ansvar av författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
Riferimenti
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Biologia dello sviluppo. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetica. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
