CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan
Summary
Burada, yalıtım ve CD4 karakterizasyonu için bir protokol+ T hücre alt kümeleri insan periferik kandan açıklanmıştır. Saf CD4+ T-hücreleri tarafından akış sitometresi T foliküler yardımcı hücresi alt kümeleri oranlarını belirlemek için analiz.
Abstract
Anormal T foliküler yardımcı (Tfh) hücre faaliyet otoimmün koşullarda tespit ve B hücreli non-Hodgkin Lenfoma lenf nodu microenvironment analiz zaman onların varlığı klinik sonuçlar ile ilişkilidir. Foliküler T yardımcı hücreleri (cTfh), dolaşımdaki bellek kartı yuvası Tfh hücrelerinin kan dolaşan alt kümeleri hastalığında da tedirgin ve bu nedenle potansiyel yeni akıllı biyolojik temsil eder. Çünkü nispeten non-invaziv ve basit seri izleme sağlar periferik kan tabanlı test avantajlıdır. CD4 izole bir yöntem bu makalede+ T-hücreleri insan kanı ve daha fazla analiz tarafından cTfh hücreleri ve çeşitli alt grupları oranlarını numaralandırmak için akış sitometresi (cTfhPD-1-/ + / Merhaba, cTfh1, 2, 17 ve cTfh1/17). Şu alt kümeleri düzeyini, normal konular ve hastalar arasında lenfoma ile karşılaştırıldı. Yöntem rutin olarak toplanan hasta malzemeden güvenilir sonuçlar elde etmek için sağlam olduğunu ortaya koymuştur. Biz analiz için tarif tekniği kolayca cep sıralama ve RT-PCR gibi aşağı akım uygulamaları için adapte edilebilir.
Introduction
Foliküler T yardımcı hücreleri (Tfh) olan bir CD4+ başlangıçta lenfoid doku1‘ karakterize edildi T-hücre alt. Bu hücreler PD-1 ve CXCR5 yüzey reseptörlerinin ifade, IL-21 ve Il-4 salgılar ve transkripsiyon faktörü, BCL-62,3nükleer ifade gösterir. Onların adından da anlaşılacağı gibi germinal merkezleri bulunur ve yüksek afinite antikor üretim1için gereklidir.
Dysregulated Tfh yanıt-e doğru hastalık patogenezinde, burada autoreactive B hücreleri4genişlemesi teşvik en önemlisi otoimmün hastalık karıştığı olmuştur. Onlar da sağlam5,6 ve lenfoid kanserleri7tümör microenvironment bir rol oynamaktadır. Tersine, insan immün yetmezlik sendromları8indüklenebilir T-hücre costimulator (ICOS) sonucu gibi yüzey proteinleri Tfh için gerekli genetik kusurların işlev. CD4+ CXCR5+ insan periferik kan hücrelerinde foliküler T yardımcı hücreleri (cTfh) dolaşan denir ve bellek kartı yuvası Tfh hücre dokuları9olduğuna inanılmaktadır. Burada anlatılan yöntemin amacı CD4 takip cTfh alt kümeleri analizidir+ hücre izolasyon periferik kan örneklerinden.
Birkaç cTfh alt kümelerini tanımlanan ve B-hücre yardım hangi ile sağladıkları verimlilik bir alt başka bir9‘ a,10,11,12farklıdır. Şu alt kümeleri göreli oranlarını en belirgin otoimmün hastalık hangi orada olduğunu hemen hemen her zaman daha işlevsel PD-1 göreceli artış çeşitli hastalıklar, değiştirilmiş+/ Merhaba ve/veya cTfh2 veya cTfh17 alt kümeleri ile karşılaştırıldığında daha az fonksiyonel PD-1– ve/veya cTfh1 alt kümeleri12. Sık sık bu değişiklikleri kapsamını ilişkilendirmek bir potansiyel rolünü, cTfh alt dağıtım hastalığında Tfh içinde faaliyet yansıtabilir prognostik bir biyomarker olarak belirten hastalık aktivite ve antikor titreleri dahil olmak üzere klinik parametrelerle lenfoid doku9,12,13,14. Ayrıca, katılımcıların kan örnekleri alarak hızlı, güvenli ve kabul edilebilir ve çok hastalık ilerleme veya tedaviye yanıt analizi için izleme seri sağlar.
İzole CD4 kullanımı+ T-hücreleri üzerinde geleneksel periferik kan mononükleer hücre (PBMNC) süspansiyonlar cTfh hücre analizi için önemli bir sayı elde etmek için gereken süreyi azaltarak daha yüksek üretilen iş akış sitometresi deneyler sağlar. Nadir cTfh alt kümeleri akışı kullanarak hücrelerden sıralama (FACS) sıralama hücre aktif hale getirildiğinde bu özellikle yararlıdır. Verimliliği yardımcı olmak için bu süspansiyonlar “örnekleri akış sitometresi deneyde kullanılacak toplu iş oluşturma özelliğinin” etkinleştirmek için cryopreserved. Sınama, CD4+ saflık değil dondurma tarafından düşürüldü.
CTfh hücreleri kendi keşif yöntemi erken dönemlerinde kategorize etmek için kullanılan farklı laboratuvarlar farklı işaretleri burada sunulan iki grup olarak Schmidt vd.12, tarafından önerilen hücre yüzey işaretlerinin birleştirilmiş planı yapar kullanın eşzamanlı kimlik cTfh ve bir tek akış sitometresi içinde dokuz tanınan alt grupları etkinleştirmek için 15 deneme.
Tek hücre yüzey işaretleri kullanılan olarak hücreleri fiksasyon veya permeabilization gerekmez ve böylece aşağı akım fonksiyonel çalışmaları için hayatta kalabilir. Bu hücre FACS ile aynı antikor paneli kullanarak sıralama kolaylaştırılmış olacak. Bu panel için kullanılan akış sitometresi kısıtlamalar izin diğer işaretler, kapsayacak şekilde genişletildi.
Çok renkli akış sitometresi deneyler Analizi 2 boyutlu nokta araziler üzerinde özellikle ne zaman hücre popülasyonlarının net bı kalıcı dağıtım olarak işaret floresans içinde yok perdeleme doğal olarak öznel olması nedeniyle zor olabilir cTfh hücreleri ve alt grupları için durum. Bu nedenle, örneğin alınma olasılığını daha iyi çözünürlük etkinleştirmek için ve stratejileri güvenle geçişi ayarlamak için el eşyaları azaltmak için etkili denetimleri ayarlama zorunludur. Bu nedenle, antikor panel tasarım ve temel akış sitometresi denetimlerinde up, yani, değerinin kullanılması deneme ve FMO denetimleri özetlenen adım 3.4.2 ve 3.4.3,respectively.
Tüm cTfh hücreleri CD4 tanımlanan+ CXCR5+ CD45RA–. Alt kümelerine PD-1–, PD-1+ veya PD-1Merhaba cTfh hücreleri tanımlamak için ifade karakteristik Tfh harekete geçirmek işaretin PD-1 düzeyde sonra belirlenir. O zaman, kemokin reseptörleri CXCR3 ve CCR6 bir arada kullanarak, hangi differentially ifade tarafından geleneksel Th1, 2 ya da 17 hücreleri, cTfh cTfh1, 2-17 gibi CXCR3 bir profil tarafından olarak karakterize edilebilir+ CCR6–, CXCR3– CCR6– ve CXCR3– CCR6+, anılan sıraya göre.
Bizim laboratuvar tarafından kullanılan antikor paneli Tablo 1‘ de görüntülenir. Kullanıcı lazer ve ışık filtresi yapılandırması için kendi yerel akış sitometresi kullanılabilir hesap için kendi fluorophore seçimi adapte olabilir.
Aşağıdaki önemli noktalar fluorophores seçimi etkiler. Parlak fluorophores mümkün olduğunda kullanın. Özellikle, en parlak kullanılabilir fluorophores üzerinde dimmest (daha az yüksek ifade) işaretleri kullanın. PD-1, CXCR3 ve CCR6, dimmer işaretleri içerir ve daha az bir ölçüde, CXCR5. Özellikle yeni BB, BV ve BUV kullanmak yapılmış mükemmel parlaklık sağlamak ve böylece hücrelerin farklı nüfusun daha kolay çözünürlüğünü etkinleştirmek fluorophores.
Fluorophore seçim spektral örtüşme ve böylece gerekli tazminat düzeyini en aza indirmek mümkün olduğu kadar emisyon spectra arasında yayıldı. Akış Sitometresi Bölmesi tasarlamaya yardımcı olmak için kullanılan ücretsiz, online alet-ebilmek bulunmak burada: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Emisyon spektrumda yer kazanmak için bir “döküm kanal” ikisi de öldü algılama (ve dışlanma) etkinleştirmek için bu APC-H7 (CD45RA için Birleşik) ile örtüşen bir emisyon dalga boyu ile bir canlılık boya kullanarak çalıştırmaya başladık ve/veya CD45RA+ kullanarak bir tek dedektör.
Burada, bir protokol yalıtım+ T-hücrelerinin periferik kan CD4 ve onların daha sonraki analiz için farklı ve son zamanlarda açıklanan alt kümeleri dolaşan oranlarını belirlemek için akış sitometresi tarafından sunulur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı periferik kan cTfh hücreleri, literatürde şimdiye kadar tanımlanan tüm ilgili alt kümeleri algılanmasını sağlayan analiz etmek için basit ve verimli bir şekilde temsil eder. Standart out-hasta klinikler ve seri örnekleri parçası klinik veri ile paralel olarak toplanabilir gibi kan örneklerini kolayca ve verimli bir şekilde elde edilebilir. Buna karşılık, bu prospektif çalışmalar hastalık ilerleme veya tedaviye yanıt için biyolojik olarak cTfh alt kümeleri değerlendirmek sa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
İş lösemi UK hibe ETB ve MJA tarafından desteklenmiştir.
Materials
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
Riferimenti
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
- Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
- Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
- Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
- He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
- Schmitt, N., Bentebibel, S. -. E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
- Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
- Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
- Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
- Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
- Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin’s lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
- Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
- Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
- Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
- Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).
