Isolamento di CD4+ T-cellule e analisi della circolazione follicolare T Helper (cTfh) sottoinsiemi di cellule da sangue periferico mediante citometria a flusso di 6 colori

Summary

Qui, un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di CD4⁺ cellula T sottoinsiemi da sangue periferico umano è descritto. Purificato CD4⁺ T-cellule sono analizzate tramite flusso cytometry per determinare le proporzioni dei sottoinsiemi delle cellule helper T-follicolare.

Abstract

L'attività cellulare aberrante T-follicolare helper (Tfh) è rilevabile nelle patologie autoimmuni e la loro presenza è associata con i risultati clinici quando viene analizzato il microambiente di linfonodo nel linfoma non-Hodgkin della B-cellula. Sottoinsiemi di fare circolare le cellule helper T-follicolare (cTfh), il vano memoria circolanti di Tfh cellule nel sangue, sono anche turbati nella malattia e pertanto rappresentano potenziali nuovi biomarcatori predittivi. Test basati su sangue periferico è vantaggioso perché è relativamente non-invasiva e permette il semplice monitoraggio seriale. Questo articolo viene descritto un metodo per isolare i CD4⁺ T-cellule da sangue umano e un'ulteriore analisi di citometria a flusso per enumerare le cellule cTfh e le proporzioni dei loro vari sottoinsiemi (cTfhPD-1^{-/ + / Ciao}, cTfh1, 2, 17 e 17/cTfh1). Il livello di questi sottoinsiemi è stato poi confrontato tra soggetti normali e pazienti con linfoma. Abbiamo trovato che il metodo era abbastanza robusto per ottenere risultati affidabili da materiale paziente ordinariamente raccolto. La tecnica che descriviamo per l'analisi può essere facilmente adattata a ordinamento delle cellule e applicazioni a valle come RT-PCR.

Introduction

Le cellule helper T-follicolari (Tfh) sono un CD4⁺ subset di cellule T che inizialmente è stato caratterizzato in tessuti linfoidi¹. Queste cellule esprimono PD-1 e i ricevitori di superficie di CXCR5, secernono IL 21 e IL-4 e mostrano l'espressione nucleare di fattore di trascrizione, BCL-6^2,3. Come suggerisce il nome, si trovano in centri germinali e sono essenziali per la produzione di alta affinità dell'anticorpo¹.

Le risposte Dysregulated Tfh sono state implicate nella patogenesi della malattia, in particolare malattia ....

Protocol

I campioni di sangue sono stati ottenuti da soggetti normali (NS) (n = 12) così come i pazienti con linfoma della zona marginale (MZL) (n = 7) e altri tipi di linfoma non-Hodgkin della B-cellula (BNHL) (FL 6 pazienti, 2 pazienti affetti da linfoma lymphoplasmacytic e della B-cellula di qualità inferiore 1 linfoma non-Hodgkin non altrimenti specificato paziente). I pazienti sono stati reclutati dalle cliniche di Ematologia presso Leicester Royal Infirmary, dopo aver dato informato, consenso scritto, con approvazione etica in luogo per tutti gli studi. Approvazione etica è stata ottenuta da Leicestershire, Northamptonshire e Rutland ricerca etica Comitato 1, riferimento....

Results

Alta CD4⁺ purezza è stato raggiunto utilizzando il CD4⁺ protocollo di isolamento, che era affidabile attraverso tutti i campioni di sangue da noi testato (significa: 96,6%, SD: 2,38, n = 31) (Figura 3).

Identificazione di cTfh (CD4⁺ CXCR5⁺ cellule) in un soggetto normale rappresentativo è presentato (Figura 4A.......

Discussion

Questo protocollo rappresenta un modo semplice ed efficace per analizzare cTfh cellule di sangue periferico, che permette la rilevazione di tutti i sottoinsiemi rilevanti identificati nella letteratura finora. I campioni di sangue possono essere facilmente ed efficientemente ottenuti come parte di ambulatori standard e campioni di serie possa essere raccolti in parallelo con i dati clinici. A sua volta, in questo modo gli studi prospettivi valutando cTfh sottoinsiemi come biomarcatori per la progressione di malattia o di.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Cocktail di arricchimento di cellule T CD4+ umane	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Topo Anti-Umano CD183  Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Topo Anti-Umano CD196 (CCR6)  Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)  Clone  RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Topo Anti-Umano CD4  Clonare   RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Topo Anti-Umano CD279  Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Topo Anti-Umano CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
Kit di colorazione per cellule morte rosse lontane fissabile/LIVE/DEAD, per eccitazione a 633 o 635 nm	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Set di particelle di compensazione Ig, κ/controllo negativo	CompBead	552843
FACS Citometro a flusso Aria II	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	acquisizione citometro a flusso
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Software di analisi dei dati per citometria a flusso
Anticorpo anti-CXCR3	BD Horizon
Anticorpo anti-CCR6	BD Horizon
Anticorpo anti-CXCR5	BD Horizon
Anticorpo anti-CD4	BD Horizon
Anticorpo anti-PD-1	BD Pharmingen
Anticorpo anti-CD45RA	BD Pharmingen
Marcatore di vitalità	ThermoFisher Scientific	L34973